研究課題/領域番号 |
26460326
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研究機関 | 近畿大学 |
研究代表者 |
重吉 康史 近畿大学, 医学部, 教授 (20275192)
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研究分担者 |
鯉沼 聡 近畿大学, 医学部, 講師 (10340770)
池上 啓介 近畿大学, 医学部, 助教 (10709330)
筋野 貢 近畿大学, 医学部, 助教 (30460843)
升本 宏平 近畿大学, 医学部, 助教 (60580529)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | 概日リズム / 視交叉上核 / 網膜 / Dead zone / メラノプシン |
研究実績の概要 |
1.明確なDead zone位相の確定、および視交叉上核遺伝子発現によるDead zoneにおける視交叉上核 当初計画:明確なDead zone位相を確定し、視交叉上核においても、Dead zoneにおける遺伝子発現が完全に阻害されているかどうかについての検討を進める。概要:マウスの自発行動を教室に設置しているセンサーにて記録し、光照射によって、位相変位が生じる時間帯と生じない時間帯すなわちDead zoneの位相を把握した。さらに行動リズムで検索された光応答位相と、光不応答位相での視交叉上核での遺伝子発現を比較した。現在、最早期遺伝子cfos, Per1, Per2遺伝子の誘導によってDead zoneを判別できることをin situ hybridization法を用いて明らかにすることができた。 2.網膜の光反応性についての検索 当初計画:網膜における光入力マーカー分子の探索から時刻依存性の情報入力の有無を検討する。さらにメラノプシン含有細胞を抗体にてラベルし、二重染色免疫組織化学法を用いて、cFosタンパクおよび時計遺伝子PER1, PER2タンパク発現を観察する。概要:網膜のRNA量が僅少であり、なおかつ眼球摘出から網膜を採取することに困難があった。特にアルビノ系のマウス、ラットにおいては網膜のみを剥離することが困難であったために、RNA抽出に困難があった。しかし眼球から網膜を単離する方法を開発したため、網膜からのRNA抽出に成功した。これを用いてメラノプシンの遺伝子をPCRによって増幅することができ、当初より予定していた網膜におけるin situ hybridization法のtemplateとすることができた。また、市販の抗メラノプシン抗体を用いた免疫組織化学法を用いてメラノプシンの網膜神経節細胞への局在を確認した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
視交叉上核における遺伝子発現によってdead zoneの検出およびその時間帯おけるマーカー遺伝子の選択については当初の予定通りに進行できている。視交叉上核の解析については、今後、細胞内情報伝達機構の解析に重点を移す。 一方で現在、遅延していると考えられるのは網膜の光照射による反応の検索である。RNAが微量であること、網膜を単離することが困難であったことから質の良い十分量のRNA採取に複数回の予備実験を要した。既知のimmediate early geneの解析およびGene chipによる網羅的解析に早急に着手する必要がある。質の高いRNAを網膜から採取し、その後の解析に供することが可能な最低限の動物数を明らかにすることができたので今後は網膜レベルでの反応を速やかに解析できると思われる。また、網膜に対する遺伝子発現の局在をin situ hybridization法を用いて検討する系を確立できた。よって、dead zoneを特徴付ける遺伝子が選択された際には速やかに局在検討が可能である。Gene chipを用いた網羅的遺伝子解析については常時、教室で施行されており、機材、消耗品なども準備できている。遅れを十分に回復可能である。
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今後の研究の推進方策 |
研究の推進に基本的手技手法を獲得したので、今年度以降はDead zoneを作り出す領域の局在を明らかにすることを目標とする。視細胞から視交叉上核に至る情報伝達経路、すなわち、視細胞>双極細胞>網膜神経節細胞のいずれにおいて遮断が生じているかを検討する。現在までに視交叉上核において、明瞭にDead zoneをとらえそれを遺伝子発現レベルで検出できた。よって視交叉上核レベルより上流の網膜における解析をまず行う。視交叉上核への入力は網膜に始まるが、網膜における光応答の有無を検討し、それによって網膜におけるDead zoneの有無を明らかにする。この時点で網羅的遺伝子解析を行い光応答のマーカー遺伝子を検索する。光応答のマーカー遺伝子が見いだされれば、その遺伝子の網膜内局在をin situ hybridizationで明らかにし、さらに抗メラノプシン抗体を用いて二重染色することによって、視交叉上核に投射するニューロンに特異的で光依存性に発現する遺伝子を見いだす。このマーカー遺伝子によって、網膜におけるDead zoneの有無を判定する。これによって検討の迅速化が図れる。 この後、網膜におけるDead zoneの有無によって検索のターゲット領域を柔軟に変更していく必要がある。網膜にDead zoneが検出された場合は光受容後の網膜内におけるメラノプシン陽性神経節細胞における細胞内情報伝達について検討する。網膜にDead zoneが存在しない場合には、視交叉上核におけるc-fos, Per1, Per2といった光誘導性の遺伝子誘導に至る情報伝達系を検索する。特にcAMP, MAPKといった物質の光応答についての検索を行い、視交叉上核腹外側部ニューロン内情報伝達の遮断によってDead zoneが形成されている可能性について検討を進める。
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次年度使用額が生じた理由 |
初年度の研究計画に従い、必要とされる消耗品を年度内に購入した結果、未使用の研究費が生じた。研究計画の中で網膜におけるDead zoneの有無についての検討が終わっておらず、その点が曖昧なまま見込みで消耗品を購入すると無駄が生じることが予想される。一方、明確な方向性が明らかになった後であれば、過不足無く消耗品を購入することが可能である。よって、一部の費用の使用を次年度に持ち越した。
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次年度使用額の使用計画 |
次年度研究計画に従い、消耗品に使用する予定である。
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