| 研究課題/領域番号 |
26460355
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
田邉 修 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 非常勤講師 (70221398)
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| 研究分担者 |
鈴木 未来子 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80508309)
横澤 潤二 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 非常勤講師 (10722605)
西川 慧 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 研究支援者 (40722616) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現制御 / βグロビン異常症 / DNAメチル基転移酵素1 / 胎児型γグロビン / ヒストン修飾 / DNAメチル化 / エピジェネティクス / グロビンスイッチング |
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| 研究実績の概要 |
βサラセミア等の遺伝性βグロビン異常症には、胎児型γグロビン誘導療法が有効であるが、そのような治療法開発にはγグロビン遺伝子の出生後の不活性化機構の解明が不可欠である。本研究では、γグロビン遺伝子不活性化におけるDNAメチル基転移酵素1 （DNMT1）の役割を明らかにするために、組換え酵素Creの作用によりDNMT1遺伝子（Dnmt1）を欠損するDnmt1 Floxアレル、内在性エリスロポイエチン受容体遺伝子（Epor）からCreを発現するEpor Creアレル、およびヒトβ型グロビン遺伝子座を導入したマウスにおいて、初期発生に必須なDnmt1遺伝子を赤血球系特異的に欠損させる。このマウスでヒトγグロビンmRNAの発現とともにその遺伝子座のDNAメチル化、ヒストン修飾などのクロマチン構造を分析する。これらの研究により、γグロビン遺伝子不活性化における抑制性クロマチン形成へのDNMT1の役割と、γグロビン誘導療法開発のための分子標的が明らかになると期待される。
24年度にはこの計画に必要なマウスを得るための交配・繁殖を行った。Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子とは同じ染色体上に存在するため、減数分裂組換えによってDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスの作成が必要である。両遺伝子間の距離は、わずか1メガ塩基であるため、代表者らは1年以上にわたる交配によりこの様なマウスを取得し、その凍結受精卵を保存していた。しかし技術的トラブルにより凍結卵からマウスを回収することができなかったため、Dnmt1 Floxアレルを持つマウスとEpor Creアレルを持つマウスとの交配を再度行った。一方、代表者らはDnmt1 FloxアレルからDnmt1欠損アレルを作成しているが、これとヒトβ型グロビン遺伝子座とを持つマウスを取得するための交配・繁殖も行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究を行うためには、同じ染色体上で1メガ塩基しか離れていないDnmt1遺伝子とEpor遺伝子のそれぞれの変異アレルであるDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上で連結したハプロタイプを持つマウスが必要である。代表者らは1年以上にわたるマウスの繁殖・交配により、減数分裂組換えによってこの様なマウスを取得し、その凍結受精卵を保存していた。26年度にはこの凍結受精卵からマウスを回収して、赤血球系細胞において、Dnmt1遺伝子のFloxアレルがCreによる配列特異的DNA組換えによって欠損アレルへと変換される効率を測定する計画であった。具体的には、Dnmt1遺伝子Floxアレルと欠損アレルの複合ヘテロ接合体変異マウスに、Epor遺伝子を利用してCreを赤血球系特異的に発現させた上で、胎児肝および成体脾の赤血球系細胞より抽出したDNAを用いて、Creによる欠失領域を検出する定量PCR解析により、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を確認する計画であった。しかしながら、凍結受精卵作成時に生じたと推定される技術的トラブルにより、凍結受精卵からマウスを回収することができなかったため、Dnmt1遺伝子のFloxアレルから欠損アレルへの変換効率を上記計画に従って測定することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度にはDnmt1 Floxアレルを持つマウス系統とEpor Creアレルを持つマウス系統の繁殖と交配を行ったが、これまでにこの研究に必要な、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスは取得できていない。Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子の間の距離はわずか1メガ塩基であり、マウスゲノムにおける減数分裂組換えの平均頻度は、1メガ塩基あたり約0.6 センチモルガンであることから、企図している組換えが起こる頻度は、1÷（0.01 x 0.6)= 167より, 170回程度の減数分裂に1回と推定される。Dnmt1 Floxアレルを持つマウスとEpor Creアレルを持つマウスとの交配では、１腹から8匹前後の仔が生まれるため、計25腹程度の仔が得られれば、このような組換え体1匹を取得できると予測される。現在はこの交配に6匹のメスを使用していることから、メス1匹につき4腹程度が得られれば、このような組換え体が取得できる計算となる。これに要する期間は、だいたい3～4ヶ月と推定されることから、27年8月までには、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスを取得できると予測される。その後12月までには、Dnmt1遺伝子のFloxアレルが、赤血球系細胞においてCreによる配列特異的組換えによって欠損アレルへと変換される効率の測定を終える予定である。さらにその後は、27年度以降に予定していた解析、すなわちヒトβ型グロビン遺伝子座のトランスジーンを導入したうえで、Dnmt1遺伝子を欠損した赤血球系細胞におけるヒト胎児型γグロビンmRNAの発現量の分析とともに、γグロビン遺伝子のDNAメチル化およびヒストン修飾の分析を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
代表者らはDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが連結したハプロタイプを持つマウスを、これらアレルを持つマウス間の交配により取得し、その凍結受精卵を保存していた。26年度には凍結受精卵からマウスを回収し、Epor Creアレルの作用によって赤血球系特異的にDnmt1遺伝子を欠損するマウスを取得する計画であった。さらに26年度にはこのマウスの赤血球系細胞のDNAを用いて、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を定量PCR解析により測定する計画であった。しかしながら凍結受精卵作成時に生じたと推定される技術的トラブルにより、凍結受精卵からマウスを回収することができなかったため、上記計画にそってDnmt1遺伝子Floxアレルから欠損アレルへの変換効率の測定を実行できず、そのために使用する予定であった野生型マウス、マウス飼料・床敷等、酵素・試薬、プラスチック器具等の購入費用が次年度（27年度）に繰越されることとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、合計 1,029,188円であるが、このうち929,188円を消耗品費に、100,000円を学会参加等のための旅費等に充てる計画である。消耗品費929,188円の内訳としては以下購入費として、野生型マウス等に140,000円、マウス飼料・床敷等に30,000円、酵素・試薬等に700,000円、プラスチック器具等に59,188円を充てる計画である。これらの消耗品の用途としては、野生型マウス、マウス飼料・床敷等は、引き続きDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上で連結したハプロタイプを持つマウスを取得するとともに、赤血球系細胞特異的にDnmt1遺伝子を欠損させたマウスを取得するための繁殖・交配に使用する。酵素・試薬、プラスチック器具等の用途としては、これらの繁殖・交配によって得られるマウスのPCR法による遺伝子型判定や、赤血球系細胞におけるDnmt1遺伝子Floxアレルの欠損アレルへの変換効率を測定するための定量PCR解析等に使用する。
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