研究課題
申請者が所属するグループで作製したDnm3os遺伝子のノックアウト(KO)マウスには骨や筋肉などが矮小であったり、形成不全が認められるという特徴がある。Dnm3osはダイナミン3遺伝子のアンチセンス鎖に存在し、マイクロRNAのmiR-199aとmiR-214をコードする。研究グループでDnm3os KOマウスにDnm3osをノックイン(KI)したところ、骨低形成等の表現型の異常はかなりの程度、回復が認められた。しかし、miR-199aやmiR-214単独のKIでは回復しなかった。そこで、申請者は本研究で両miRNAの同時ノックイン動物の作製を試み、作製に成功した。本マウスではmiR-214の発現量は有意に低いレベルであったが、特に椎骨の融合不全の解消や生後の低体重の回復が認められたことから、両miRNAがKOマウスで認められた表現型の責任遺伝子であることが明確に示された。本マウスを用いてDNAアレイの分析を実施している。また、miR-199a/214は心肥大や虚血後の腎傷害モデルにおいて発現量が増加することが示されている。筆者らは、ETAR遺伝子座へのmiR-199a/214のノックイン動物においてドキソルビシンの投与による心筋の線維化が抑制される現象を確認しているが、このマウスの組織について、特に抗酸化系と細胞の構造や接着に関与するの遺伝子の発現の変化に重点を置いて分析を行ったが、明確な変化はまだ確認できていない。miR-199a/214の発現量が不足している可能性も考えられるので、組織特異性を持ったマイクロRNAの高発現マウスを得ることが重要と判断し、Dnm3osの遺伝子座にCre-ERT2を、ROSA26遺伝子座にmiRNAをノックインした動物の作製を先行して作業している。
3: やや遅れている
マイクロRNAのノックイン(KI)マウスについて、Dnm3os遺伝子座へのmiR-199a/214のノックイン動物の作製に時間を要した。そのため、DNAマイクロアレイによる分析などの進行が遅れている。しかし、ノックアウト(KO)動物で確認された表現型の変化が両miRNAの発現により回復することが確認でき、両miRNAの組織形成における重要性を明らかにするという目的は達成できた。KIマウスではmiR-214の発現量が野生型やヘテロマウスと比べて低かったことが問題と考えられた。表現型解析のためにはmiRNAの発現量が組織特異的に確固として増加することが望まれる。そこで、26年度に予定していた心筋および腎傷害モデルにおける解析に先行して、当初は次年度以降に予定していたROSA26遺伝子座へmiR-199a/214ををノックインしたマウスの作製作業を進めている。
Dnm3os遺伝子ノックアウト(KO)動物で見られた表現型へのmiR-199a/214の関与は明らかになったので、その標的遺伝子の選定について作業を進めていく予定である。しかし、マイクロRNA (miRNA)ノックイン(KI)マウスではmiR-214の発現量が野生型やヘテロマウスと比べて低かったことが問題と考えられた。これは心臓や腎臓の傷害におけるマイクロRNAの意義を解析するためのエンドセリンA受容体(ETAR)の遺伝子座へのノックイン動物を用いた実験でも問題となる可能性が考えられた。また、Dnm3osのKO (Dnm3os遺伝子座がLacZ/LacZ)マウスではヘテロ(同、Dnm3os/LacZ)マウスとくらべて遺伝子発現量の違いが2倍以上発現量が異なり、発現量が有意かつ性差等に依存せずに変化したものは極めて少なかった。表現型解析のためにはmiRNAの発現量が確固として変化することが望まれる。そこで、心筋および腎傷害モデルにおける解析に先行して、Dnm3osの遺伝子座にCre-ERT2をノックインしたマウスと、当初は次年度以降に予定していたROSA26遺伝子座へmiR-199a/214ををノックインしたマウスの作製を先行するべきと考え、Cre-ERT2システムによりコンディショナルにマイクロRNAの発現誘導が可能な動物の作製を進めている。これらのマウスを作出することで表現型の責任遺伝子の候補の選定が実行しやすくなると期待している。ETARについても同様に、この遺伝子座にCre-ERT2を導入したマウスを作製することで表現型と責任遺伝子の検索がより確実にに行えると期待しており、作製した動物や、その胚線維芽細胞を使用することにより、研究を進め、傷害耐性を発揮する下流遺伝子や細胞機序を明らかにしていく予定である。
miR-199a/214のノックイン(KI)マウスの作製が遅れたため、移行の解析が遅れた。特にDNAマイクロアレイによる解析のための費用を次年度に利用することとした。また、KIマウスではmiR-214の発現量が低かったことから、高い発現量が期待されるマウスを作製することとし、Dnm3osの遺伝子座にCre-ERT2をノックインしたマウスと、当初は次年度以降に予定していたROSA26遺伝子座へmiR-199a/214ををノックインしたマウスの作製を先行するよう計画を変更した。そのため、心筋および腎傷害モデルの解析に関する費用が次年度に繰り越された。
Dnm3os遺伝子ノックアウト(KO)動物で見られた表現型へのmiR-199a/214の関与は明らかになったので、その標的遺伝子の選定についてDNAマイクロアレイなどを利用して遺伝子発現の変化について解析作業を進めていく予定である。また、ROSA26遺伝子座にマイクロRNAを導入したマウスとコンディショナルに誘導可能なCre-ERT2マウスを作製して、両者を交配することでマイクロRNAを本来の発現部位で時期特異的に高レベルで誘導可能なコンディショナルマウスを得る。これらを分析に供することで表現型と責任遺伝子の検索を推進する予定である。
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Developmental Biology
巻: 15 ページ: -
10.1016/j.ydbio.2015.04.007
http://bio.m.u-tokyo.ac.jp/publication.html
