| 研究課題/領域番号 |
26460376
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
柳沢 健 自治医科大学, 医学部, 教授 (50182366)
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| 研究分担者 |
多胡 憲治 自治医科大学, 医学部, 講師 (20306111)
太田 聡 自治医科大学, 医学部, 助教 (40528428)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ST2 / LPS / TLR4 / CD14 |
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| 研究実績の概要 |
膜結合型ST2タンパク質（ST２L）はIL-33の受容体であるが、その分泌型であるST2タンパク質は細胞外でIL-33のデコイ受容体としてIL-33のシグナルを抑制する。しかし、その他にST2タンパク質はIL-33に非依存的に単球系細胞や樹状細胞におけるLPSのシグナル伝達を抑制する事を、われわれは見出した。そこでST2タンパク質のLPS受容体複合体との結合機構を解明するため、レトロウイルスによるST2タンパク質の発現系を構築した。ST2を発現させたNIH3T3細胞の培養上清を回収し、ニッケルカラムにより精製を行い、約3μgのST2タンパク質を回収した。ST2タンパク質にはGFPタグを融合させているため、これを用いてLPS受容体を発現している細胞とST2タンパク質の結合を検討することが可能となった。LPS受容体複合体の構成タンパク質に関しては、TLR4とCD14をNIH3T3細胞の表面に発現させるレトロウイルス発現系を構築した。TLR4にはC末にFLAGタグが融合してあり、TLR4の発現はFLAGに対する抗体により、CD14の発現は抗CD14抗体によりウエスタンブロティングで確認した。また、CD14の発現はFACSによっても確認できた。さらに、レトロウイルスの発現系でCD14のC末端にタグをつけ、細胞表面にGPIアンカーで結合できず細胞外に分泌される分泌型CD14タンパク質を発現させた。この可溶化CDタンパク質とST2タンパク質の直接的結合を免疫沈降法により検討したが、結合しないという結果が得られた。現在、NIH3T3細胞を用いて、CD14単独、TLR４単独、CD14とTLR４双方を強制発現する細胞の作成を終了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在のところ、ST2タンパク質、LPS受容体を構成する、２つの主要な膜在性タンパク質であるTLR4、CD14の発現系の構築を終了し、ST2タンパク質に関しては精製系も機能する事を確認した。また、CD14の分泌型タンパク質を構築発現し、ST2タンパク質との直接的結合を検討したが、結合しない事が判明し、他の可能性を検討する必要があることがわかった。NIH3T3細胞をもとに、TLR4単独、CD14単独、TLR4とCD14双方を強制発現させた細胞を作製し、その後の解析にとりかかれる状態である。
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| 今後の研究の推進方策 |
分泌型のCD14はST2タンパク質に結合しなかったが、膜結合型のCD14は単独でST2に結合するかを検討する。また、TLR4単独、あるいはTLR4とCD14を共発現させたNIH3T3細胞を用いて、ST2-GFPタンパク質の結合を蛍光顕微鏡と、FACSによって検討する予定である。また、蛍光ラベルしたLPSを用いて、これも蛍光顕微鏡とFACSにより、LPS受容体複合体への結合と、ST2がその結合に及ぼす影響を検討する。
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