| 研究課題/領域番号 |
26460378
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| 研究機関 | 熊本保健科学大学 |
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研究代表者 |
矢野 正人 熊本保健科学大学, 保健科学部, 准教授 (60315299)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / 膜タンパク質 / シグナル伝達 / ストレス / ABCB10 / TMEM65 |
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| 研究実績の概要 |
過去の申請者らによるスフィンゴミエリン合成酵素1（SMS1）ノックアウト（SMS1-KO）マウスの解析結果から、SMS1の欠損は、酸化ストレスの亢進やミトコンドリア機能の低下だけでなく、ミトコンドリアストレス応答の活性化を引き起こすことがわかった。また、その際、ABCB10やTMEM65の発現量が増加することがわかった。さらに、哺乳類のABCB10は、線虫のHAF-1と同様に、ミトコンドリアストレス伝達経路上においてミトコンドリアのマトリックス内から細胞質側にシグナル性のペプチドを放出する役割を担っていると推定されていた。実際にABCB10およびTMEM65について解析を行ったところ、平成25年度までに、ABCB10に関しては、発現量を低下させると細胞の増殖速度が低下することがわかった。また、局在・機能ともに不明であったTMEM65に関しては、ミトコンドリア内膜の膜タンパク質であることがわかった。
以上のこれまでの研究結果をふまえ、平成26年度の本研究においては以下の解析を行った。培養細胞内のABCB10やTMEM65をノックダウンさせた際の他のmRNAの発現量をリアルタイムPCR法により調べた。その結果、ABCB10をノックダウンした場合には、各種ミトコンドリアストレス応答因子の発現量が低下していた。また、酸化ストレス応答因子やATP合成酵素の発現量にも変化が見られた。一方、TMEM65をノックダウンした場合には、ミトコンドリアストレス応答因子、酸化ストレス応答因子、ATP合成酵素の発現量に大きな変化は見られなかったが、脂質代謝関連因子の発現量が有意に増加していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ABCB10のノックダウンによる各種遺伝子の発現レベルの変化をリアルタイムPCR法により調べた。その結果、ABCB10をノックダウンした場合には、各種ミトコンドリアストレス応答因子（ミトコンドリア内で働く分子シャペロンやプロテアーゼ類）の発現量が低下することがわかった。このことから、ABCB10はミトコンドリアストレス応答に必要な因子である可能性が非常に高いと考えられた。一方、TMEM65をノックダウンした場合には、調べた範囲内では、ミトコンドリアストレス応答因子の発現量に大きな変化は見られなかった。このことから、TMEM65はミトコンドリアストレス伝達経路に直接関与しない可能性が出て来た。しかし、TMEM65が脂質代謝関連因子の発現量に影響を与えることが示唆されたことから、現時点で機能未知タンパク質であるTMEM65の機能を今後解析してゆく上での重要な手掛かりを得ることができた。このように「ABCB10やTMEM65の機能を他の遺伝子の発現状況から推察する」というアプローチでの解析については、大きく研究を進展させることができた。一方で、本年度に実施する予定であった「ABCB10がペプチドトランスポーターとして機能している可能性の検討」については、未だ実施できておらず、来年度以降の課題として残された。以上の自己評価を総合的に判断し、研究目的達成度の区分は「おおむね順調に進展している。」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度のノックダウン実験の結果から、哺乳類のABCB10が線虫のHAF-1と同様の役割（ミトコンドリア内膜のペプチドトランスポーターとして働き、シグナル性のペプチドを放出することで、ミトコンドリア内のストレスを細胞質側に伝達し、核におけるミトコンドリアストレス応答因子の発現を上昇させる役割）を担っている可能性が高くなった。現時点でABCB10のペプチドトランスポーターとしての機能を解析するための準備（ABCB10のドミナント・ネガティブ株（ATPase活性消失型ABCB10過剰発現株）の作製など）は既に完了しているので、遅くとも平成27年度内には解析に着手したいと考えている。また、TMEM65に関しては、ミトコンドリアストレス応答経路に直接関与する可能性は低くなったものの、新たに脂質代謝に関与する因子である可能性が出て来た。今後、Gene Chip解析の結果など参考にし、主に、ノックダウン法とリアルタイムPCR法を用いて、TMEM65の機能解析を更に進めてゆく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ミトコンドリア回収用およびミトコンドリア活性測定用の試薬類を購入する予定であったが、平成26年度内での発注が困難な状態であったため、平成27年度に購入することにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ミトコンドリア回収用およびミトコンドリア活性測定用の試薬類の購入費用として使用する予定である。
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