研究課題
研究代表者らは血管新生が出生直後から観察されるマウス網膜を用いた網羅的発現解析を実施し、出生前後で発現が顕著に変動した遺伝子群の中からこれまでに血管新生に関連することが示唆されることが報告されていない複数の候補遺伝子を獲得している。さらに、マイクロアレイ実験で検出されたこれらの遺伝子の発現変動の定量結果は、我々が独自に構築した高感度な定量PCR法（Adachi et al., Genes Cells, 2015）により再現されることが明らかになった。そこで本年度は、マウス血管内皮細胞株（TKD2）においてこれらの候補遺伝子の発現をノックダウンすることが血管新生に与える影響を評価するための実験系を構築した。まず、IN CELL ANALYZER (GE Healthcare)を用いて、コラーゲンゲル上に播種することによって血管新生様のネットワーク状構造を誘導した24時間後のTKD2の顕微鏡画像から細胞の面積や伸長量といった血管新生能を数値化するためのマクロを構築した。本マクロを用いた画像解析の結果、TKD2の細胞面積は播種密度に依存して増加した。また、細胞伸長量は播種密度が2.5×105 cells/mL以上で飽和したことから、TKD2の血管新生の評価に最適な播種密度を決定することができた。次に、Gapdhに対するsiRNAをコントロールとして用いてTKD2におけるsiRNAの導入条件の至適化を試みた。その結果、1.0 μL/wellのLipofectamine RNAiMAX (invitrogen) を用いて10 nMのsiRNAをTKD2に導入した時にGapdhの発現が80%以上抑制されることが明らかになり、今後候補遺伝子のノックダウン解析を実施する際にも本条件を採用することとした。
2: おおむね順調に進展している
本年度は、マウス血管内皮細胞株（TKD2）の血管新生能（細胞面積や伸長量）を画像解析により数値化する実験系およびTKD2において特定の遺伝子をsiRNAによりノックダウンする実験系の至適化を完了することができたことから、血管新生に関連することが期待される候補遺伝子が機能的に血管新生に関与しているか否かを評価するための準備が整ったものと考える。
本年度に確立したTKD2の実験系を用いて、血管新生に関連する候補遺伝子およびそれらの周辺遺伝子（シグナル伝達系の上流・下流の遺伝子や同一ファミリーに属する遺伝子など）のノックダウン解析を実施し、血管新生に関連する新規遺伝子の同定を目指す。
本年度に実施した血管新生の評価系の構築が順調に進展し、消耗品費が当初の見込みより若干少額で済んだため。
本研究の最終目標である血管新生に関連する新規遺伝子を同定するために、候補遺伝子およびそれらの周辺遺伝子のノックダウンに必要なsiRNAの合成費用として適切に使用していきたいと考えている。
すべて 2016 2015
すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 3件、 査読あり 4件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件)
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