研究課題
自閉症や学習障害，注意欠陥多動性障害などの発達障害と診断される児童の数は年々増加傾向にある。近年の発達障害患者の全ゲノム解析により，MDB5（メチル化CpG結合ドメインタンパク質5）が欠失あるいは重複している症例が数多く報告された。しかしながら，MDB5はメチル化CpG結合ドメインを有するにもかかわらず，メチル化CpGへの結合能が明確に示されないため，その機能は未だに不明であり，発達障害の発症機序における役割は全く分かっていない。そこで本研究では，神経細胞におけるMBD5のターゲット遺伝子の同定,さらにその制御メカニズムを明らかにすることにより，MBD5の脳での機能を明確にすると共に，メチル化CpG結合ドメインタンパク質を介したエピジェネティクスと発達障害との関連を解き明かすことを目的とする。我々は神経分化におけるMBD5の役割を解析するため，ゲノム編集技術の一つであるジンクフィンガーヌクレアーゼを用い，神経細胞様に分化誘導出来るヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞株でMBD5のノックアウト株を樹立し，マイクロアレイ解析によりMBD5+/-により発現変化を呈する遺伝子のスクリーニングを行った。その結果，microRNAやsnRNAなどのnon-coding RNAの占める割合が極めて高く，それらnon-coding RNAの発現制御に関わっている可能性が示唆された。最近，Rett症候群の原因遺伝子であるメチル化CpG結合ドメインタンパク質MeCP2がmicroRNAの発現制御や選択的スプライシングの機構に関与していることが報告され，メチル化CpG結合ドメインタンパク質の新たな機能として注目されている。そこで， MBD5がmicroRNAの発現制御や選択的スプライシングの機構にどのように関与しているのかを解析することにより，脳におけるMBD5の作用機序を明確にする。
2: おおむね順調に進展している
これまでの研究で，ジンクフィンガーヌクレアーゼを用い，神経細胞様に分化誘導出来るヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞株でMBD5のノックアウト株を樹立し，マイクロアレイ解析によりMBD5+/-により発現変化を呈する遺伝子のスクリーニングを行った結果，発現上昇を認めた遺伝子（transcripts）を71個，発現低下を認めた遺伝子（transcripts）を92個同定しており，現在，MBD5のターゲット遺伝子の機能解析を行っており，概ね順調に進展している。
前年度自立したMBD5+/- iPS細胞株を神経細胞に分化誘導し，その分化能を解析する。MBD5と同様のメチル化結合タンパク質であり，精神神経疾患Rett症候群の原因遺伝子であるMeCP2変異iPS細胞では，神経細胞への分化誘導の際，成熟神経細胞への分化効率の低下，シナプス活動の減少，細胞体・核サイズの減少などが認められることから，MBD5+/- iPS細胞株でも同様の表現形が認められるか否かを注視して解析する。また，MeCP2はYB-1 (Y box-binding protein 1)と結合し，選択的スプライシングの調節に関与していることが報告されている。本研究で明らかにしたMBD5ターゲット候補遺伝子のほとんどは選択的スプライシングを受ける遺伝子であることから，同じドメイン構造を持つMBD5も同様の機構に関与している可能性が十分考えられる。そこで，MBD5とYB-1及びスプライシング関連分子SRタンパク群との相互作用をIPにより解析する。さらに，これまでの解析でMBD5のターゲットであり，脳において何らかの機能を持っていると考えられる遺伝子（transcripts）についてMBD5遺伝子領域を欠失，重複した発達障害患者のサンプルで，発現異常の有無を解析する。患者サンプルは，海外共同研究者のDr.Weksberg保有のサンプルを使用する。更に，MBD5+/- iPS細胞株および正常iPS細胞を神経細胞に分化誘導し，それらで発現の異なる遺伝子をRNA-seq解析により同定する。その中から，これまでSH-SY5Y細胞株の実験で同定されたMBD5ターゲット候補遺伝子（transcripts）と共通のものも有力候補として抽出し，同様に患者サンプルでの発現異常を解析する。
MBD5+/- iPS細胞株および正常iPS細胞における遺伝子発現解析を当初予定していたマイクロアレイ解析から次世代シークエンサを用いたRNA-seq解析に変更したことで時間を要し，RNA-seq解析に係る費用の執行が次年度になったため。
MBD5+/- iPS細胞株および正常iPS細胞における遺伝子発現解析を次世代シークエンサを用いたRNA-seq解析に変更し，それに係る費用に使用する。
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Plos Genetics
巻: 12 ページ: -
10.1371/journal.pgen.1005802
http://chromosome.w3.kanazawa-u.ac.jp/horike/index.html
