| 研究課題/領域番号 |
26460411
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
三浦 史郎 久留米大学, 医学部, 講師 (00441650)
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| 研究分担者 |
柴田 弘紀 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (80315093)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | IQGAP3 / 遺伝性ニューロパチー / エクソーム / 連鎖解析 / non coding RNA |
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| 研究実績の概要 |
1) 罹患者におけるIQGAO3遺伝子の異常スプライス産物発現の検出 まずIQGAP3がコントロールリンパ球cDNAに発現していることを確認後、さまざまなプライマーペアにて異常スプライス産物の検出を試みた。その結果、本来イントロンであると考えられていた部位がコントロールcDNAでも存在することが判明した。さらなる検索の結果、当該部位はnon coding RNA内にあることが判明した。このnon coding RNA内の一塩基変異がIQGAP3や他の遺伝子の発現の発現を変化させているという仮説が推測された。
2) 改良版のキットを用いたエクソーム解析 改良版のキットを用い、新たに患者１名・家系内健常者1名エクソーム解析を行ったが、新たな結果は得られず、IQGAP3の当該変異が候補として残った。
3) 新たな家系メンバーのリクルートと連鎖解析 新たに４名を加え、連鎖解析を行ったが、領域の更なるしぼりこみにはいたらなかった。
4) フラグメント解析による異常伸張リピートをもつ遺伝子探索 CAG/CTGが１０リピート以上の部位は連鎖領域内に５箇所あったため、すべてにおいてフラグメント解析を行ったが、患者と健常者で違いは認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
＃抹消血リンパ球でのIQGAP3発現に罹患者と健常者で差があるかどうかをリアルタイムPCRで調べたところ、コントロールcDNAや家系内健常者由来cDNAでは安定した結果が得られているが、患者由来cDNAでは結果が家系内健常者由来cDNAと比較して０～２倍となり、安定した結果が得られていない。
＃異常スプライス配列検出のためのPCRの結果が安定しない。
＃当初は異常スプライス産物が病因に関与していると仮定していたが、当該変異を含むnon coding RNAが病因に関与している可能性が浮上した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）２箇所にプローブを設定し、リアルタイムＰＣＲ法にてIQGAP3発現を家系内健常者と家系内罹患者で比較する。
２）患者（HMSNPC8）と健常者（HMSNPC7）由来のcDNAからPCR・TOPO cloningにてnon coding RNA領域のフラグメントを作成する
３）作成したフラグメント２種類をpGL4.10やpGL4.23といったプロモーター有無のベクターに挿入する（順方向・逆方向ともに作る）
４）培養神経細胞を用いて作成したベクターをトランスフェクションし、RNA・たんぱく質を抽出し、リアルタイムＰＣＲやウエスタンブロッティングにてIQGAP3の発現を調べる
５）同時に平行してマイクロアレイで遺伝子発現変化を網羅的に調べる
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| 次年度使用額が生じた理由 |
キャンペーン利用や業者選定等、なるべく安く物品購入しようとした結果、残額が生じてしまいました。大変申し訳ありません。
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| 次年度使用額の使用計画 |
試薬・キット等が昨年よりも値上げされているものがあるので値上げ分の補てんにあてる予定です。
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