| 研究課題/領域番号 |
26460443
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| 研究機関 | 愛知医科大学 |
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研究代表者 |
稲熊 真悟 愛知医科大学, 医学部, 講師 (80410786)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 軟部腫瘍 / ヘッジホッグ / 転写因子 / GLI1 |
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| 研究実績の概要 |
滑膜肉腫細胞株SW982にレンチウイルスを用いて、GLI1およびLacZを導入し、これらの遺伝子を安定発現するSW982細胞を樹立した。遺伝子安定発現細胞株を用いて、qRT-PCR解析およびWestern blottingを行い、GLI1がCXCL12-CXCR4シグナルの構成因子であるCXCR4, CXCR7, LCP1の発現を誘導することを明らかにした。次いで、CXCR4のプロモーター配列を用いてレポーターアッセイを行い、プロモーター領域内のGLI1結合配列(GBS)を明らかにするとともに、クロマチン免疫沈降法を用いてGLI1がGBSに結合していることを証明した。また、GLI1を発現したSW982細胞株は、CXCL12に対する化学走化性が亢進していることを、boyden chamber法を用いて明らかにした。一方で、GLI1はSW982細胞株の細胞分裂能を亢進させることも明らかにした。以上より、ヘッジホッグシグナル系転写因子GLI1は、滑膜肉腫細胞において、その細胞分裂能やCXCL12-CXCR4シグナル依存的な化学走化性を制御することで、その悪性形質を制御している可能性を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の研究計画では、滑膜肉腫細胞株SW982とユーイング肉腫細胞株RD-ESにGLI1ER融合遺伝子を安定発現させ、β-estradiolを用いて標的遺伝子発現を誘導し、転写因子GLI1の標的遺伝子同定および機能解析を行う予定であった。しかしながら、対照群においてβ-estradiolによる副反応が観察されたことから、レンチウイルスを用いた遺伝子安定発現法に変更したところ、SW982細胞に関しては安定発現株を樹立することができ、GLI1による明瞭な遺伝子発現誘導が観察された。また、細胞分裂能やCXCL12に対する化学走化性も効果的に評価することが可能となり、本研究計画を順調に進めることが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、当初の研究計画通りに、LacZ, GLI1安定発現滑膜肉腫細胞株を用いて、GLI1が腫瘍細胞の薬剤耐性能を制御するかを検討する。また、これらの細胞株における発現遺伝子を網羅的に解析し、細胞分裂能、薬剤耐性能に関連した遺伝子群、シグナル経路の同定を目指す。
一方で、EWS-FLI1, SYT-SSX1, PAX3-FKHRといった軟部腫瘍発生に重要だと考えられる融合遺伝子をヒト間葉系幹細胞株に導入し、各融合遺伝子によって発現制御がなされる遺伝子群を同定することで、腫瘍発生に重要なシグナル経路、メカニズムを明らかにすることを試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
比較的速やかに実験計画を遂行することができ、試薬やプラスチック製品など消耗品の消費が比較的少量で済んだ点、およびcDNAアレイを用いた網羅的遺伝子解析が、次年度に持ち越されたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度より持ち越された、cDNAアレイを用いた網羅的遺伝子解析を行う予定である。
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