| 研究課題/領域番号 |
26460487
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
河崎 秀陽 浜松医科大学, 医学部, 助教 (90397381)
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| 研究分担者 |
岩下 寿秀 浜松医科大学, 医学部, 教授 (00283432)
小杉 伊三夫 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (10252173)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | サイトメガロウイルス / iPS / 三次元培養 / neurovascular unit |
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| 研究実績の概要 |
日本では毎年約1000人の神経障害をもった症候性サイトメガロウイルス(CMV)患者が発生している。ダウン症につぐ大きな先天異常であり毎年膨大な医療費を必要とする。CMV先天異常の新たな感染機序を解明することは将来の先天CMV感染の予防・治療にとって必要不可欠である。今まで大脳CMV感染機序の解析はマウスモデルを中心に行われた。ヒト大脳でのCMV感染実験には限界があるため、ヒトCMV中枢神経感染機序はほとんどわかっていない。2013年にヒトiPS/ES細胞から大脳立体組織を作成するという画期的な方法が報告された。2012年にはヒトiPS細胞から血液脳関門(BBB)をin vitroで再現する新しい技術も発表された。
今回の研究ではこれらの新しい技術を用いて、申請者らが提唱してきたマウス大脳CMV感染モデルをヒトモデルで検証し、ヒトCMV中枢神経感染特有の新たな病理機序の解明や治療法につなげることを目的としている。
まず申請者らはヒトiPS細胞より3次元大脳組織を安定的に作成するための技術を獲得する計画である。作成されたヒト3次元大脳組織を用いてHCMVの感染実験を行い、今まで申請者らが提唱してきたマウスCMV大脳感染モデルがヒト大脳モデルにおいても成り立つかを検証する。次に血行性大脳感染時においてHCMVがいかにしてBBBの破綻を引き起こし、脳実質に侵入するのかを検索する予定である。そのためにヒトiPS細胞より血管内皮細胞、血管周皮細胞を分化・分離後にin vitroヒトBBB 3次元モデルを作成し、CMV感染実験を行う計画である。
現在はヒト新生児皮膚線維芽細胞にOCT3/4, SOX2, c-MYC, Klf4を導入し、ヒトiPS細胞を樹立した。樹立後ヒトiPS細胞の未分化マーカーの発現を確認し、現在feeder freeの状態で安定的なiPS細胞培養方法を獲得した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今回申請ではヒトiPS細胞由来の大脳組織を安定的に供給できる方法を詳細に検索し明らかにする。そして作成された大脳の高次構造の確認を行った後に、マウス大脳CMV感染モデルの検証・解析を行う予定であった(①～④)。次にHCMVがBBBの破綻を如何にして引き起こすのかをin vitro BBBヒトモデルで実験し、 MMP9, CyPA因子を中心にCMVのBBB破綻機序の解析をする（⑤,⑥）。
以下が①～⑥までの計画の詳細である。①：ヒト3次元培養脳においてHCMV感染で小頭症を誘発するか否かの検討。②：ヒト3次元培養脳におけるSOX2、nestin陽性神経幹/前駆細胞のHCMV感染感受性の確認。③：神経幹細胞より分化した新生ニューロンの移動がHCMVによって阻害されるか否かを解析。④：ニューロンでHCMVが持続感染するのか否か、ヒト三次元培養脳で明らかにする。⑤：ヒトiPS細胞より血管内皮細胞、血管周皮細胞を分化させ、transwellに付着培養させる。in vitro BBBモデルを確立した後にHCMVを感染させ、BBBの透過性の亢進性を検討する。⑥：HCMV感染後のBBBにおけるCyPA, MMPの蛋白発現量の変化や、MMPによる蛋白分解能を調べる。またBBB破綻に関わる新規蛋白の検索や、BBB保護作用のある薬物を検索する。
現在はヒト新生児皮膚線維芽細胞にOCT3/4, SOX2, c-MYC, Klf4を導入し、ヒトiPS細胞を樹立した。樹立後ヒトiPS細胞の未分化マーカーの発現を確認し、現在feeder freeの状態で安定的なiPS細胞培養方法を獲得した。しかしヒトiPS細胞から３次元培養脳の作製の条件の確定ができず、計画が遅れている。また以前の科学研究費の計画であった研究成果がAmerican journal of pathologyにacceptされたが、そのacceptまでの作業によって①～⑥までの当初の計画に遅れがでている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後以下の実験を推進していく予定である。
(1)ヒトiPS細胞より3次元大脳組織の作成・培養方法の確立(①～⑤)①：ヒトiPS細胞作成：倫理委員会で承認を得たヒト新生児皮膚線維芽細胞にセンダイウイルスで山中因子（OCT3/4, SOX2, c-MYC, Klf4）を導入し、iPS細胞を誘導する。iPS細胞樹立後には未分化マーカーの確認と、多分化能の確認を行う。また定期的に染色体検索を行う。すでにヒトiPS細胞の樹立には成功しているが、新たなiPS細胞を樹立するときには同様の過程を行う予定である。②：ヒトiPS細胞約4500個を非接着性96穴プレートに移し、ROCK阻害剤とともに培養し、Embryoid body（EB）を作成する。EBは6日間培養後の非接着性の24穴のプレートに移す。③：EBはDMEM/F12, N2, Glutamax, MEM, heparinを含有した神経分化培養液に移し替える。5日後、パラフィルムの上に置いた冷えたdroplet matrigel（BD bioscience）に神経上皮に分化した細胞塊を移し替える。37℃でmatrigelが固まった後、大脳分化培地（DMEMとneurobasalを1:1の割合で混合した基本培地にN2, B27, mercaptoethanol, insulin、Glutamaxを含有した培地）にて4日間静かに培養する。④：その後大脳分化培地（前述の培地からB27をのぞき、vitamin Aを含んだ培地）の中で神経細胞塊をバイオリアクアクターで攪拌し、酸素と栄養を細胞塊に均一に供給させながら大脳組織を成長させる。⑤：②から④までを実行することにより大脳組織が安定的に作成されると予想される。しかし何種類もあるmatrigelのどれが最適なのか、攪拌培養時の最適攪拌スピードなどの細かい条件設定は論文に記されておらず、試行錯誤の中から安定した培養条件を探索する予定である。
作成された三次元大脳組織が実際にヒト大脳構築をもっているか否かの検証を行う。
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