| 研究課題/領域番号 |
26460489
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
太田 康晴 山口大学, 医学部, 准教授 (60448280)
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| 研究分担者 |
田口 昭彦 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20634744) [辞退]
秋山 優 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (90717547)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生体リズム / インスリン分泌 / DBPシグナル |
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| 研究実績の概要 |
膵β細胞機能もコア時計遺伝子により制御されていることが報告されたが、その制御機構には不明な点が多い。我々は、マウスインスリン1プロモーター下で転写抑制系の時計遺伝子E4BP4を発現するトランスジェニックマウス（以下TG）を作製し、インスリン分泌不全による耐糖能障害の表現系を明らかにするとともに、そのインスリン分泌障害のメカニズムに関しての解析を行った。10コピーのトランスジーンをもつCライン、3コピーのトランスジーンをもつDラインはともに有意な高血糖をきたすが、高脂肪食負荷によってCラインではより顕著な高血糖が認められたため、耐糖能障害の程度に対するE4BP4のgene-dosage effectがより明確となった。Static incubation法によるインスリン分泌実験では、TGの高グルコース刺激に対するインスリン分泌量の低下が認められたが、高カリウム刺激に対しては有意なインスリン分泌量の低下は認められなかった。膵灌流実験では、TGにおいてインスリン分泌第１相の遅延と分泌量の低下が認められた。Cラインでは、インスリン含量及びβ細胞量の低下、β細胞数の減少とラ氏島の構造異常が認められた。単離ラ氏島のリアルタイムRT-PCRによる、時計関連遺伝子、インスリン分泌関連遺伝子の発現とその概日リズムの解析を行った。幾つかのインスリン分泌に関連する遺伝子の発現は、マウスが摂食を開始するZeitgebertime12に向かって徐々に発現が増加する傾向が認めらるが、 Cラインから単離したラ氏島では、それらの遺伝子発現の増加が認められなかった。時計遺伝子の発現リズムの異常がインスリン分泌不全を伴う耐糖能障害を引き起こす際に、DBPの転写活性化シグナルが重要な役割を担っており、特にfirst mealに対する速やかなインスリン分泌の準備において重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウスインスリンⅠプロモーター下で転写抑制系の時計遺伝子E4BP4を発現するトランスジェニックマウス（MIP-E4BP4マウス）を作製し、現在、なお解析中ではあるが、このマウスがインスリン分泌不全による耐糖能障害をきたすことは確実であり、糖代謝におけるMIP-E4BP4マウスの糖代謝における表現型はほぼ明らかにできていると考えている。野生型マウスの膵ラ氏島におけるDBP mRNAの発現は、摂食開始時に最大となり、E4BP4 mRNAの発現は、摂食開始時に最小となる概日リズムを示すことから、DBPの転写活性化シグナルは、摂食開始時から数時間の間に最大となると考えられる。この時間帯で、野生型のラ氏島では、インスリン分泌に関連する幾つかの遺伝子（Glut2、Rab37など）の発現は、１日のうちで最も増加するが、MIP-E4BP4マウスのラ氏島ではこれらの遺伝子の増加が認められない。MIP-E4BP4マウスでは、膵β細胞特異的に過剰発現した転写抑制因子であるE4BP4が競合的にD-boxに結合するため、DBPシグナルが膵β細胞特異的にほぼ欠失されていることが想定される。DBPシグナルの欠失によって、インスリン分泌に関連する幾つかの遺伝子発現が低下し、インスリン分泌不全、特にfirst mealに対するインスリン分泌不全が引き起こされていると考えることができる。つまりDBPシグナル活性が十分でない時間帯に摂食を繰り返すことにより、高血糖が増悪し、糖尿病の発症や進行につながる可能性がある。以上のことより、時計遺伝子異常が膵β細胞機能不全ひいては糖尿病を引き起こす経路の一端を解明しつつあることから、概ね、計画通りに研究が遂行出来ていると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
第一にMIP-E4BP4マウスにおけるインスリン分泌不全のメカニズムをより明らかにしたいと考えている。このマウスでは、高カリウム刺激でのインスリン分泌には有意な変化が認められないことから、グルコース取り込みからグルコース代謝を経て、KATPチャネルの閉鎖に至るまでの段階になんらかの障害が生じていると考えている。現在、単離ラ氏島におけるATP/ADP比の計測を行っており、この比に異常が認められれば、グルコース取り込み、グルコース代謝、ミトコンドリア機能のいずれかのステップでの障害がインスリン分泌障害を引き起こしている可能性が高くなると考えている。ChIPシークエンス解析の結果から、ATPとADPの変換に影響を与えると思われる分子で、DBPシグナルによって直接的に発現調節されていると思われる候補が見つかっており、この分子をアデノウイルスの系を用いて単離膵ラ氏島に過剰発現させる実験や、shRNAを発現させる実験を行って、機能解析を進めていきたい。できればこの分子の遺伝子欠損マウスの作製を試みたい。また、MIP-E4BP4マウスの膵ラ氏島を用いたマイクロアレイやChIPシークエンス解析はすでに行っているが、RNAシークエンスによる網羅的解析はまだ行えていない。RNAシークエンスによって、網羅的解析も引き続き進めていきたい。特にZeitgebertime12近辺のサンプルを用いることによって、より情報量が多いデータが得られる可能性が高いと考えており、できればこの時間帯のサンプルを用いて解析を進めたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
使用したマウスの個体数が当初予定していたよりも少なく、その分、動物飼育費も予定していたよりも少なかった。論文も何度か投稿したが、publishに至らなかったため、それにかかる費用も発生しなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
2015年6月にアメリカ糖尿病学会（ボストン）で発表することが決まっており、その旅費に充てたい。また、一部は論文発表にかかる経費にも充てたいと考えている。
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