| 研究課題/領域番号 |
26460520
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
後藤 隆次 岐阜大学, 生命科学総合研究支援センター, 助教 (80326355)
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| 研究分担者 |
田中 香お里 岐阜大学, 生命科学総合研究支援センター, 教授 (20242729)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 嫌気性菌 / Bacteroides fragilis / 薬剤耐性機構 / カルバペネム耐性 / 薬剤排出ポンプ |
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| 研究実績の概要 |
腸管常在の嫌気性菌 Bacteroides fragilis のカルバペネム耐性は化学療法で時に深刻な問題を引き起こす。当該研究はカルバペネム中等度耐性に寄与する新規耐性因子の同定と構造・機能解析を行う事である。当該年度では B. fragilis のゲノム DNA ライブラリーを作製し、新規耐性因子の同定と構造解析を試みた。具体的には、メロペネムの最小発育阻止濃度（MIC）が 16 ug/ml を示した B. fragilis GAI92214 株を研究対象株として選出した。次に、ライブラリー作製用大腸菌宿主がカルバペネム高度感受性である事を確認した（メロペネム MIC 値: 0.04 ug/ml）。また、本大腸菌株へのプラスミド導入効率は最大で1240000000 cfu/ug であった。次に、GAI92214 株ゲノムをランダムに切断した断片（3～5 kb 分画）を pHSG398 ベクターへ挿入し、高精度のゲノムライブラリーを作製した。本ライブラリー中の約 40000 個クローンの中からメロペネム耐性を示すクローンを幾つか選出し、各挿入断片の塩基配列決定を行ったが、現時点では未だカルバペネム耐性に寄与する配列は得られていない。
今後は、以下の様な別の方策も同時進行し、研究目的の早期達成を図りたい。(１) スクリーニング用培地中にエチジウムブロマイドやローダミンを加え、薬剤排出ポンプをコードするクローンを選出後、カルバペネム耐性への貢献度を解析 (２) Bacteroides 属の染色体変異導入プラスミドを用いて変異株ライブラリーを作成し、新規耐性因子の同定を試みる (３) 他機関で報告済された B. fragilis 染色体全配列情報等を利用して、GAI92214 株における排出ポンプやポーリン、ペニシリン結合タンパク質配列の変異と耐性との相関関係を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
我々は、B. fragilis のカルバペネム中等度耐性に寄与する新規耐性因子を同定するために、メロペネムの MIC 値が 16 ug/ml を呈した B. fragilis GAI92214 株を研究対象株として選出した。耐性因子を同定する手段として、始めに GAI92214 株のゲノム DNA ライブラリーを作製するが、その際に使用する大腸菌宿主株（KAM3⊿tolC株）はカルバペネム高度感受性であり（メロペネム MIC値: 0.04 ug/ml）、後の実験用に有用な宿主である事が確認された。また、本大腸菌へのプラスミド pHSG398 と pSTV28 の導入効率は、順に、415000000 と 1240000000 cfu/ug であり、当宿主がライブラリー作製に有用である事が示された。次に、GAI92214 株ゲノムの部分消化断片（突出末端）（4～7 kb および 7～10 kb の 2 通りの分画）を、上記 2 種のプラスミドベクターにライゲーションさせ（1:1～10:1 間のモル比）、KAM3⊿tolC 株への形質転換を行ったが、良質なライブラリーは得られなかった。そこで、物理的切断後に平滑末端化した消化断片 3～5 kb 分画を pHSG398 ベクターへ挿入した結果、高精度のゲノムライブラリーを作製する事ができた（挿入断片保有率 80 %）。
現時点で、本ライブラリー中の約 40000 個の組み換え大腸菌の中からメロペネム耐性を示すクローンを選出した結果、約 2.5 kb の挿入断片を持つ耐性クローンを 3 個得る事ができたが、各挿入断片の塩基配列決定の結果、カルバペネム耐性に寄与する遺伝子配列は現時点では未だ得られていない。これは耐性因子が当該大腸菌内で十分に発現していない可能性や、大腸菌宿主の染色体変異による耐性クローン出現等の可能性を示唆している。
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| 今後の研究の推進方策 |
作成したライブラリーについて、目的の耐性クローンを得るべく、スクリーニングに使用するクローン数を増やすなどの工夫をすると同時に、研究を早期に完遂させるためにも、以下に示す様な 3 つの方策も検討・推進する。
(１) 耐性因子が薬剤排出ポンプの場合を想定して、スクリーニング用培地中にエチジウムブロマイドやローダミンを加え、耐性を示したクローン（薬剤排出ポンプをコード）の挿入配列を決定し、当該タンパクのカルバペネム耐性への貢献度を解析する。
(２) Bacteroides 属の染色体をランダムに変異導入できるプラスミドベクターを他研究機関から恵与頂ける方向となったため、本プラスミドを用いて、GAI92214 株の変異株ライブラリーを作成し、その中から、変異によりカルバペネム感受性になる株を選出後、変異導入部の周辺遺伝子の配列を決定する事により、新規耐性因子の同定を試みる。
(３) 耐性因子が薬剤排出ポンプや薬剤分解酵素である場合は、これまでの方法で同定可能であるが、ポーリンやペニシリン結合タンパク質の変異がカルバペネム耐性に寄与している場合は、従来の方法では同定できない。そこで、既知の B. fragilis 全染色体配列等の情報を利用して、GAI92214 株におけるポーリンやペニシリン結合タンパク質の各遺伝子領域を増幅しクローニング後、当該タンパク遺伝子の変異とカルバペネム感受性との関係を解析する事で、耐性に寄与する因子を同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究対象菌株である B. fragilis GAI92214 株のゲノム DNA ライブラリーを作製する過程において、高品質・高精度のライブラリーを作製する事が予想以上に遅れた。また、目的遺伝子を選出する作業にも時間を要した。
上記理由により、当該年度内に購入・実施予定であった薬剤感受性試験などの物品購入を次年度以降の購入予定とした。試薬の保存性を考えると実験直前の購入が望ましく、当年度内に購入して長期保管する事は望ましくないと判断した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ゲノム DNA ライブラリーを用いた実験が難航しているため、新たな別の方策を検討している。例えば、研究対象菌株である B. fragilis の染色体をランダムに変異できるツールを用いて、目的遺伝子を選出するなど。この際、プラスチックシャーレ、プラスチックプレート、菌株レプリカ用ナイロン膜、菌株釣金用の剣山など、当初の研究計画には無かった商品を購入する必要が出てきた。これらの物品購入のために前年度未使用額を使用したい。
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