| 研究課題/領域番号 |
26460531
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
比嘉 直美 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 技術専門職員 (70457688)
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| 研究分担者 |
高江洲 義一 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60403995)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 感染防御・制御 / 炎症 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は腸炎ビブリオの3型分泌装置が分泌するエフェクタータンパクVopQによるカスパーゼ-1の活性化阻害機構、および個体レベルでの感染過程におけるその役割について明らかにすることである。
本年は具体的にVopQとオートファジーの機能的関連性を明らかにするため、Cre/loxPシステムを用いたATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスの作製に取り掛かった。
また、VopQの宿主細胞内標的分子として、酵母Two-hybridスクリーニングで相互作用する分子の同定を試み、その分子が細胞膜構成成分で細胞接着に関与するAfadinであることがわかった。マウス大腸細胞CMT93やヒト大腸がん細胞Caco2、マクロファージなど各種細胞に腸炎ビブリオ野生株およびVopQ欠損株を感染させ、市販のAfadin抗体を用いて宿主細胞内におけるAfadinをウエスタンブロット法で確認した。同時にカスパーゼ-1や炎症性サイトカインの検出も行った。また免疫染色の手法により、感染時のVopQの存在の有無でAfadinがどのように影響されているかを感染後、経時的に免疫染色を行い観察した。
腸炎ビブリオはヒトに対して下痢等の腸管感染症を起こすが、マウスでは経口感染モデルの感染成立が難しい。しかし、生体内でのエフェクタータンパクの機能を評価する為に動物感染モデルは重要である。マウスにストレプトマイシンを前投与し常在菌を抑えた状態で、大量の腸炎ビブリオ（ストレプトマイシン自然耐性株）をC57BL/6野生型マウスに経口投与することにより、強制的にマウスの腸管炎症を起こすモデルの構築を行った。小腸、盲腸、大腸に分けて、菌の分離を行い菌数を確認した。また、小腸、盲腸、大腸をホルマリン固定後、組織の凍結切片を作製し、菌や免疫細胞等の免疫染色を行い、組織学的、病理学的に炎症の有無を比較検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
オートファジーの解析のためのATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスの作製では、Cre/loxPのC57BL/6野生型マウスへのバッククロスが不充分であったため、ATG5欠損の発現が一定ではなかった。そのため、バッククロスをN7世代以上にする為に繁殖交配を続けている。それ以外の研究はおおむね予定通りに進行しており、VopQと相互作用する宿主細胞内標的分子の同定を試み、Afadinであることが分かった。腸管内炎症を解析する為のマウスモデルの構築も行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
ATG5欠損コンディショナルノックアウトマウス（Lyz2-Cre Atg5flox/flox）作製に関しては、C57BL/6 backgroundの各マウス(Atg5flox/flox, Lyz2-Cre）を交配させて作製する。得られたLyz2-Cre Atg5flox/floxのコンディショナルノックアウトマウスの骨髄より分化させたマクロファージを用いて、腸炎ビブリオ野生株およびVopQ欠損株感染におけるカスパーゼ-1の活性化を検証する。それ以外にも、オートファジーを起こさない状態で、炎症誘導における様々な事象の検証が行える。また、VopQと相互作用する宿主内細胞分子として同定したAfadinはマウス大腸上皮細胞において細胞膜構成成分であり、感染時のVopQの有無による違いは免疫染色による観察ではわからなかった。骨髄から分化させたマクロファージにおけるAfadinは免疫染色により、核内成分として存在していることが分かった。VopQとの関連はこれから詳細に解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度は腸炎ビブリオエフェクタータンパクVopQのオートファジーへの関連を解析するために、Cre/loxPシステムを取り入れたATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスを作製する予定であった。しかしコンディショナルノックアウトマウスの作製において、当初の予定より時間がかかり、今年度では実験に供することができるマウスの作製には至らなかった。その為、オートファジー解析関連に必要な抗体購入費用等、一部の予算を次年度に繰り越すことにした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初の予定通り、ATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスを作製し、当該マウス骨髄細胞より分化したマクロファージを用いて、腸炎ビブリオ野生株とVopQ欠損株を感染させ、カスパーゼ-1活性化及び、サイトカインの産生をウエスタンブロッティング法やELISA法、免疫染色法を用いて解析し、野生型マウス由来マクロファージと比較することにより、オートファジーの関連性を解析する。
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