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2015 年度 実施状況報告書

マダニ媒介性新興感染症起因の難培養性アナプラズマ科細菌を標的としたメタゲノム解析

研究課題

研究課題/領域番号 26460532
研究機関静岡県立大学

研究代表者

大橋 典男  静岡県立大学, 食品栄養科学部, 教授 (10169039)

研究分担者 吉川 悠子  日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 助教 (00580523)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード細菌 / ゲノム / 新興感染症 / Anaplasma / マダニ媒介 / Neoehrlichia
研究実績の概要

アナプラズマ科細菌には、マダニ媒介性新興感染症の「ヒト顆粒球アナプラズマ症」および「ヒトネオエーリキア症」の病原体であるAnaplasma phagocytophilumやNeoehrlichia mikurensisが含まれている。日本国内では、これらの細菌が未だに分離されていないため、その基礎微生物学的知見が極めて乏しい。そこで、本研究では、難培養性アナプラズマ科細菌に感染した媒介マダニや野生動物の検体を用いて、メタゲノム解析を駆使することにより、これら細菌のゲノム情報を含む分子遺伝学的知見を蓄積することを目的とした。昨年度は、当研究室が保持していたA. phagocytophilum感染シュルツェマダニの唾液腺の全DNAをGenomiPhi V2によりまるごと増幅したDNA(GPa-DNA)を用いて、16S rDNAを標的としたメタゲノム解析を実施し、A. phagocytophilumのゲノム情報が取得可能と思われる1匹のシュルツェマダニを見出して、そのゲノム解析を開始した。当該年度はこのゲノム解析を推進させた。具体的には、GPa-DNAを酵素切断した400 bpほどのライブラリーを作製して次世代シーケンス解析(シングルシーケンス)を6回行い、さらにメイトペアライブラリーを作製し次世代シーケンス解析を1回行った。その結果、totalで8,976,356個の塩基配列 (reads) を得ることができた。そして、A. phagocytophilum米国ヒト分離株のゲノムをreferenceとしたアッセンブル・ギャップクローズ解析を行った結果、1,473,258 bp、265,943 reads、221 contigs、50.52 coverageから成るScaffoldを得ることに成功した。その後、このScaffoldを基に、ドラフトゲノム配列を作成した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

おおむね順調に進んでいる。当該年度は、これまでに見出したA. phagocytophilumが多量に感染しているシュルツェマダニについて、その唾液腺DNAのライブラリーを用いて、国内初のA. phagocytophilumのドラフトゲノム配列の取得を主な目的としていた。ライブラリー作製のためのマダニ唾液腺DNA(GPa-DNA)には、大量の宿主マダニDNAが混入しているので、これらの中からA. phagocytophilumの十分なゲノムDNA情報を得るためには、次世代シーケンサー(Ion torrentシステム)解析におけるread数を増やす必要があった。そして、シングルシーケンスで6回、メイトメアシーケンス1回の解析から、最終的に約900万readsを得て、このreadsのA. phagocytophilum米国ヒト分離株のゲノムをreferenceとしたアッセンブル・ギャップクローズ解析から221 contigs・50 coveragesから成る 1.47MbのA. phagocytophilumのドラフトゲノム配列を作成することに成功した。現在、ドラフトゲノム配列中で信頼度の高い配列についてAnnotationを開始し、また異なる長さのメイトペアシーケンス用ライブラリーの作製も進めており、これらのメイトペアライブラリーの次世代シーケンス解析により、ドラフトゲノム配列からコンプリート配列の構築を目指している。

今後の研究の推進方策

現在、得られた国内のA. phagocytophilumのドラフトゲノム配列からコンプリート配列の構築を目指して、異なる長さのメイトペアシーケンス用ライブラリーの作製を進めている。これらのメイトペアライブラリーの次世代シーケンス解析により、contig数が大幅に減少することが期待でき、ドラフトゲノム配列に存在する多くのギャップがかなり埋まるものと考えられる。しかし、完全にギャップが埋まらない可能性もあり、その場合はcontig数にもよるが、PCRによるギャップクローズ解析も視野に入れている。また、同時に、得られたドラフトゲノム配列中で信頼度の高い配列についてはAnnotationを推進させる。さらに、A. phagocytophilum以外では、N. mikurensisのゲノム情報の取得についても進める予定である。N. mikurensisの場合は、N. mikurensisが感染したマダニの唾液腺GPa-DNAと野ネズミの脾臓DNAが利用可能であるが、宿主のマダニや野ネズミからの相当量のDNAの混入が考えられる。よって、total read数をかなり増やす必要があると考えている。最近、N. lotoriのゲノム配列が公表されたので、これをreferenceにして、得られるreadsをマッピングすることが可能となった。よって、少なくともN. mikurensisのドラフトゲノム配列までは取得できるものと期待している。このようにして、次世代シーケンス解析を駆使し、国内初のA. phagocytophilumおよびN. mikurensisのゲノム情報を蓄積したい。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (8件)

  • [雑誌論文] Prevalence of Borrelia miyamotoi in Ixodes persulcatus in Irkutsk City and its neighboring territories, Russia.2016

    • 著者名/発表者名
      Khasnatinov, M. A., Danchinova, G. A., Takano, A., Kawabata, H., Ohashi, N., Masuzawa, T.
    • 雑誌名

      Ticks Tick Borne Dis.

      巻: 7 ページ: 394-397

    • DOI

      10.1016/j.ttbdis.2015.12.016.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Molecular and serological survey of Rickettsiales bacteria in wild sika deer (Cervus nippon nippon) in Shizuoka prefecture, Japan: High prevalence of Anaplasma species.2015

    • 著者名/発表者名
      Wu, D., Wuritu, Yoshikawa, Y., Gaowa, Kawamori, F., Ikegaya, A., Ohtake, M., Ohashi, M., Shimada, M., Takada, A., Iwai, K., Ohashi, N.
    • 雑誌名

      Jpn. J. Infect. Dis.

      巻: 68 ページ: 434-437

    • DOI

      doi: 10.7883/yoken.JJID.2015.003.

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Anaplasma phagocytophilum specific P44 epitopes identified by peptide array analysis2016

    • 著者名/発表者名
      蘇泓如, 呉東興, 伊藤圭祐, 河原崎泰昌, 大橋典男
    • 学会等名
      第89回日本細菌学会総会
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2016-03-23 – 2016-03-25
  • [学会発表] Whole genome shotgun sequencing of Ixodes persulcatus infected with Anaplasma phagocytophilum T162 (cutting-edge report)2015

    • 著者名/発表者名
      Ohashi, N., Takamoto, N., Wu, D., Tai H.
    • 学会等名
      第22回リケッチア研究会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2015-11-28 – 2015-11-29
  • [学会発表] アナプラズマ-情報update2015

    • 著者名/発表者名
      大橋典男
    • 学会等名
      第22回リケッチア研究会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2015-11-28 – 2015-11-29
  • [学会発表] 静岡県における日本紅斑熱の疫学的考察2015

    • 著者名/発表者名
      川森文彦, 池ヶ谷朝香, 荒畑沙織, 酒井悠希子,佐原啓二, 大橋典男
    • 学会等名
      第22回リケッチア研究会
    • 発表場所
      東京
    • 年月日
      2015-11-28 – 2015-11-29
  • [学会発表] アナプラズマ科細菌感染症に関する最近の話題について2015

    • 著者名/発表者名
      大橋典男
    • 学会等名
      第23回ダニと疾患のインタフェースに関するセミナー (SADI) 東日本大震災復興祈念大会
    • 発表場所
      名取
    • 年月日
      2015-06-26 – 2015-06-28
  • [学会発表] 野生動物におけるリケッチア目細菌の分子疫学調査2015

    • 著者名/発表者名
      呉東興, 大橋典男, 烏日図, 高娃, 吉川悠子, 川森文彦, 池ヶ谷朝香
    • 学会等名
      第23回ダニと疾患のインタフェースに関するセミナー (SADI) 東日本大震災復興祈念大会
    • 発表場所
      名取
    • 年月日
      2015-06-26 – 2015-06-28
  • [学会発表] One-tube nested PCRによるOrientia tsutugamushiの検出2015

    • 著者名/発表者名
      川森文彦, 池ヶ谷朝香, 荒畑沙織, 佐原啓二, 大橋典男
    • 学会等名
      第23回ダニと疾患のインタフェースに関するセミナー (SADI) 東日本大震災復興祈念大会
    • 発表場所
      名取
    • 年月日
      2015-06-26 – 2015-06-28
  • [学会発表] 静岡県におけるSFTSウイルスの浸淫実態2015

    • 著者名/発表者名
      池ヶ谷朝香, 荒畑沙織, 佐原啓二, 川森文彦, 大橋典男
    • 学会等名
      第23回ダニと疾患のインタフェースに関するセミナー (SADI) 東日本大震災復興祈念大会
    • 発表場所
      名取
    • 年月日
      2015-06-26 – 2015-06-28

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公開日: 2017-01-06  

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