| 研究課題/領域番号 |
26460560
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
松井 政則 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (50199741)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | ワクチン / ウイルス様粒子 / ナノキャリア / アジュバント / ドラッグデリバリー / 細胞傷害性T細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、SV40ウイルスから作製したウイルス様粒子 (VLP: virus-like particle) を使用して、新しいワクチンプラットフォームを開発することを目的としている。我々は、Influenza A virus のmatrix protein 由来のHLA-A2拘束性CTL エピトープである FMP 58-66 を、SV40 VLPの表面に導入した(VLP-FMP-58-66)。この VLP-FMP-58-66 を、HLA-A2 トランスジェニックマウスに投与して免疫すると、効率よくFMP特異的 CTLが誘導できた。特筆すべきは、この免疫に副作用を伴うアジュバントを加える必要がなかったことである。すなわち、SV40-VLP自体に、自然免疫系を活性化するセルフ・アジュバント機能があると考えられる。
本研究年度では、主に、このVLPの刺激によって、どのように自然免疫系が活性化されるのか、そのセルフ・アジュバント機能のメカニズムを解析した。SV40-VLPをマウスリンパ球に反応させると、自然免疫活性化の指標であるCD86などの分子の発現が増強した。そして、これらの分子が発現誘導されるさまざまな免疫担当細胞を解析した。さらに、VLPで刺激した免疫担当細胞からmRNAを抽出し、次世代シーケンサーでRNAシーケンスを行い、また、免疫沈降物の質量分析を行い、発現量に変化がある遺伝子を網羅的に探索した。VLP刺激による細胞内シグナル伝達経路の解析も行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成26年度においては、SV40-VLPの刺激で自然免疫を活性化する、セフル・アジュバント機構を解析する事が当初の計画であった。すなわち、VLPの刺激によって発現増強する分子を、さまざまな免疫担当細胞について解析し、その刺激で活性化されるシグナル伝達系の解析を行う事であった。そして、そのシグナル経路を介して誘導・発現される細胞内の分子を網羅的に解析することが期待された。実際には、VLPの刺激を加えると、リンパ球において、自然免疫活性化の指標となるCD86などの細胞表面分子の発現が増強されることがわかった。そして、B細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞などの免疫担当細胞においてその増強がみられた。さらに、次世代シーケンサーを使って、網羅的なトランスクリプトーム解析を行った。また、免疫沈降物の質量分析を行った。SV40-VLPで刺激した細胞と刺激していない細胞で、mRNAを抽出してRNAシーケンスを行い、発現量に変化が有る遺伝子を探索したところ、有意義に発現量が増えている分子、因子をいくつか同定した。今後は、CRISPR/Cas9 system等を利用して、これらの分子の発現増強が、実際にSV40-VLPの刺激によっておこること、またそれが自然免疫活性化に関係することなどを証明する必要がある。以上のように、今のところ、当初の計画どおりに進展しており、現在までの達成度は高い自己評価となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、SV40-VLPの刺激で自然免疫を活性化するセルフ・アジュバント機構をさらに詳細に解析し、そのメカニズムを明らかにする。具体的には、網羅的トランスクリプトーム解析によって発現増強が検出された分子に関して、CRISPR/Cas9 システムによってそのゲノム遺伝子をノックアウトした細胞を作製する。その細胞に、SV40-VLPの刺激を作用させ、自然免疫が活性化されるかどうかを、液性因子の分泌や活性化マーカーの発現量で調べ、SV40-VLPの刺激による自然免疫活性化に関わる分子を同定する。さまざまな遺伝子をノックアウトするためのCRISPR/Cas9プラスミドをたくさん作製し、細胞に導入するため、かなり時間がかかると思われる。重要な実験であるため、次年度だけで時間が不十分であれば、その次の年度も続けて実験を行う。さらに、HLA-A2拘束性反応だけでなく、HLA-A24拘束性反応も検討する。すなわち、HLA-A24トランスジェニックマウスを用いて、HLA-A24拘束性エピトープまたは抗原タンパク質を結合したSV40-VLPを作製し、 これを免疫する事により、HLA-24拘束性CTLが、やはりアジュバント無しで誘導できるかどうかを検討する。次年度、時間に余裕があれば、粘膜ワクチンの展開を考える。SV40-VLPは、経鼻接種においても、有効に細胞性T細胞を誘導できることがわかっている。この効果を、HLA-A2, HLA-A24トランスジェニックマウスを使って、詳細に検討する。
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