| 研究課題/領域番号 |
26460657
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
浅井 さとみ 東海大学, 医学部, 准教授 (60365989)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 薬剤耐性 / 緑膿菌 / アシネトバクター / 耐性獲得機構 / 排出ポンプ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では多剤耐性緑膿菌(MDRP)や多剤耐性アシネトバクター(MDR-Acinetobacter baumannii, MDR-A. baumannii) 臨床菌株において見られる多段階の耐性化と遺伝子変異の相互関係、耐性遺伝子獲得発現の関係を調査し、それに基づく検査診断法の開発および多剤耐性化回避法の確立を検討することを目的とする。
１．薬剤耐性緑膿菌（多剤耐性緑膿菌および２剤耐性緑膿菌）について
①既存の耐性遺伝子発現の状態について臨床分離株を用いて詳細に調査したＨ25年度までの研究結果に基づき、耐性獲得関与遺伝子の発現について統計学的分析を行った。②薬剤耐性化への進展に重要な役割を示す薬剤排出ポンプの発現亢進に注目した。異なるシークエンスタイプの耐性緑膿菌において、その約95％で薬剤排泄ポンプに関与する複数のmex遺伝子の発現亢進が認められた。そこで薬剤排出ポンプの構成蛋白の基質となるペプチドを供給するβ-barrel assembly machinery (BAM)複合体に着目した。グラム陰性菌の外膜に存在するBAM複合体は5つの異なるタンパク質の集合体（BamA、BamB、BamC、BamD、BamE）から構成されている。BamAとBamDに着目し、ウエスタンブロット法を用いて検討している。
２．薬剤耐性アシネトバクター（多剤耐性および２剤耐性A. baumannii）について
開院以来２度目の院内アウトブレイクにおいて、水道の蛇口から水道管の深部まで汚染されている状況（感染源）を証明し、臨床分離株の耐性機構を検討した。耐性株のシークエンスタイプ（ST）はST219で、前回のアウトブレイク時に検出されたST208と同様CC92に属する菌株であった。多剤耐性化には、すでに研究者らがST208について解析し論文発表した結果と同様の、βラクタマーゼの発現に不可欠なISAba1発現とarmA遺伝子、排出ポンプの一部の軽度発現亢進が関与していることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．①薬剤耐性緑膿菌の耐性獲得関与遺伝子の発現について統計学的分析がほぼ終了し、論文作成の準備が整った。②Bamのウエスタンブロット法の抗体作製に難渋したが。標準株と比べ耐性獲得株はBamAおよびBamDのいずれも軽度発現亢進傾向にあることが確認された。しかしながら、比較的感受性のある株であっても臨床分離株では発現が亢進する傾向が一部で認められた。
２．薬剤耐性A.baumannii臨床分離株においては、臨床分離株ST219の耐性獲得機構に関与する遺伝子の発現について論文にまとめ投稿することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．①論文執筆を進める。②他のパーツ（BamB、BamC、BamE）でのタンパク質発現も順次確認する予定し、最も変化がわかる遺伝子をターゲットとし、real time RT-PCR法で発現の差を確認する。今後、それらのデータを解析し簡易診断システムの構築を行う。
２．薬剤耐性 A.baumannii臨床分離株の耐性獲得に共通に関与する遺伝子を検討し、簡易迅速診断法の構築を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ウエスタンブロット法の抗体作製に難渋し、耐性緑膿菌に関する研究が進まなかった。また、前年度からの結果に基づきアシネトバクター関連論文の作成にかなりの時間を費やし、実験の時間を取ることが困難であった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本研究で必要な費用は、消耗品費にて購入する消耗品や試薬は研究遂行において必須の細菌培養、薬剤感受性試験、分子生物学的解析・タンパク発現解析、ペプチド作製等に用いる。RNA抽出試薬、逆転写酵素、DNA合成試薬、PCR、RT-PCR、real time PCR法のプライマー作製費用や抗菌薬を含む試薬類、ウエスタンブロット法に必要な試薬類、培養に必要な薬品類、液体培地、血液寒天培地、培養フラスコやプレートチップ、チューブ類などの消耗品がほとんどを占めており、これらは実験を行う上で必須の物である。PCR法、real time PCR法、ウエスタンブロット法、シークエンス解析機は、当該施設所有のものを借用する。これらの機器・装置を使用するための試薬キットは、その都度購入する。情報収集と研究成果発表のための学会参加費用として国内旅費を毎年計上した。また、研究成果の発表報告のため外国論文校閲費と印刷費を計上している。
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