| 研究課題/領域番号 |
26460660
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
湊 宏 金沢医科大学, 医学部, 教授 (10293367)
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| 研究分担者 |
竹上 勉 金沢医科大学, 総合医学研究所, 教授 (10113490)
中田 聡子 金沢医科大学, 医学部, 助教 (30569091)
三浦 裕 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90285198)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 悪性中皮腫 / ATBF1 / 癌抑制遺伝子 / 培養細胞 / 細胞内局在 / 核細胞質移行 / 遺伝子ノックアウト / リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
悪性中皮腫における癌抑制遺伝子ATBF1の役割を探索する目的で、ヒト悪性中皮腫細胞株3種(NCI-H2452、MSTO-211H、NCI-H28)と良性中皮細胞株1種(Met-5A)の培養を継続している。本年度は特にMet-5Aの亜株を中心にATBF1遺伝子変化との関連性を探索した。Met-5Aのそれぞれの亜株に、ATBF1のshRNA発現レトロウイルスを加え、ATBF1のノックダウンモデルを作成した。リアルタイムPCRでATBF1のmRNAが対照に比較し、2亜株で減少していることを確認した。また、同様にATBF1のノックアウトモデルとしてCRISPR処理を試みた。Met-5Aの20亜株に数種のCRISPRを試みたところ4株に遺伝子挿入変異が確認できた。また、プラスミドを用いてATBF1-EGFPを取り込んだ細胞株を作成した。
ATBF1の細胞増殖能における影響をみるため、上記の処理を加えたMet-5Aの亜株に、対照を含めそれぞれLuc遺伝子の導入を行った。それらの細胞がルシフェラーゼ活性を有していることを発光イメージングシステム(IVIS)を用いて確認後、それぞれの細胞をヌードマウスの腹腔内に注入し、現在発光量の変化を観察中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初はATBF1のリン酸化の有無を中心に検討する予定であったが、新しい遺伝子操作技術であるCRISPRが可能になったことから、直接ATBF1遺伝子を細胞レベルで変異させ、マウス生体内での細胞増殖能の変化をみることを優先した。今後各種悪性中皮腫細胞株と良性中皮細胞株においてATBF1遺伝子をノックダウンあるいはノックアウトさせ、複数のマウス体内での細胞増殖の変化をみることと、セルブロック作成によるATBF1蛋白発現量の変化とその細胞内局在、ウエスタンブロット法による蛋白量の変化をみることで、ATBF1の悪性中皮腫における癌抑制遺伝子としての可能性を解明できると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
shRNAによるATBF1遺伝子のノックダウンやCRISPRによるノックアウトする方法を用いて、複数のマウス体内での細胞増殖の変化をみることと、セルブロック作成によるATBF1蛋白発現量の変化とその細胞内局在、ウエスタンブロット法による蛋白量の変化をみることで、ATBF1の悪性中皮腫における癌抑制遺伝子としての可能性を解明できると思われる。さらにATBF1のリン酸化や脱リン酸化の有無に関しても解析していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ATBF1のウエスタンブロット法を安定させるため実験予定が長引いている。また、ATBF1の抗体作製とその解析が当初の計画より、時間がかかっている。そのため、補助事業の年度内の完了が困難となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
ウエスタンブロットに関しては、温度と時間、ゲル濃度を変化させ成功させ、他の実験とともに研究を遂行していく。抗体に関しては、次年度の予算と合わせて、抗体作製とその解析を行う予定である。
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