| 研究課題/領域番号 |
26460706
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
柴田 護 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60286466)
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| 研究分担者 |
清水 利彦 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (40265799)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / TRPV1 / オートファジー / ミトファジー / ミトコンドリア / 侵害性刺激 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、代表的な疼痛疾患動物モデルを作成し、一次感覚ニューロン (primary sensory neuron: PSN)のミトコンドリアにどのような変化が引き起こされているかを解析することである。本研究の実施方法であるが、培養細胞のアッセイを用いた系と齧歯類頭痛モデルの系を用いた実験に二分できる。基礎的なデータを得るためにも、侵害性刺激の受容に関与するTRPV1 (transient receptor potential vanilloid subfamily, member 1)を安定的に発現するPC12クローンを用いた研究を先行させた。生細胞のミトコンドリアの染色には、MitoTracker Red CMXRosを用いた。TRPV1発現は、GFPの融合蛋白としてベクターを作成してあるので、蛍光顕微鏡で確認できる。TRPV1のアゴニストであるカプサイシン (10 microM)を培養液に加えたところ、3時間後にミトコンドリア数はvehicle (0.1% DMSO)を加えた群に比較して減少を認めた。カプサイシンの効果がTRPV1を介した反応であることを確認するために、TRPV1の阻害薬であるカプサゼピン (50 M)を前投与したところ、ミトコンドリア数の減少は阻害された。一方、カプサイシンを24時間作用させた細胞では、ミトコンドリア数はvehicle群と比較して有意な変化を呈さなかった。これは、ミトコンドリアの新生が生じたためと推察している。動物自験では、侵害受容性疼痛モデルを作成し、三叉神経節標本で、電子顕微鏡観察を行った。その結果、オートファジーの誘導が2日後より観察された。空胞の一部にミトコンドリアも認められた。6日後には、オートファジー誘導は鎮静化していたが、小型のミトコンドリアが目立ち、ミトコンドリア新生が生じているものと推察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TRPV1の刺激が、ミトコンドリアの減少とそれに引き続く新生を引き起こす可能性を、培養細胞と実験動物の両者の系で明らかに出来たことが主な進展と言える。この結果の意義は、TRPV1の刺激がミトコンドリアのターンオーバーを引き起こすことを示したことであり、さらにオートファジーが重要な作用を果たすことを確認できたことである。
また、動物実験では、モデルの適切性を確認することが重要であった。侵害受容性疼痛のモデルとして、三叉神経支配領域に10 mMカプサイシンを含む脱脂綿を30分間投与することで、局所の皮膚発赤を引き起こし、さらにvon Frey hairによる痛覚過敏と、Orofacial Pain Assessment Device (OPAD)で熱疼痛刺激の閾値低下を確認することが出来た。その上で、前述の三叉神経節ニューロンでのオートファジー誘導とミトコンドリア新生が確認できたが、今後はオートファジー誘導を阻害した際に、三叉神経節ニューロンの形態や疼痛閾値にどのような影響が生じるのかを解析していくことが重要と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
①細胞実験
TRPV1の刺激によるミトコンドリア数の変化にオートファジーが関与するのであれば、オートファジー実行に関与する蛋白質のどれが重要な働きをしていくのか同定する必要がある。そのためには、Atg5, Atg7, Beclin1/Atg6などのsiRNAを行って、TRPV1によるオートファジー誘導に阻害がかかるかを確認する。また、我々はBeclin1に関しては、野生型のみならずドミナントネガティブな作用を有する変異体を発現するベクターも有しているため、これらの蛋白質の過剰発現がオートファジー誘導に如何なる影響を与えるかについても検討したい。
②動物実験
当初の計画に従って、炎症性疼痛疾患モデル・神経障害性疼痛疾患モデル・片頭痛モデルの作成し、電子顕微鏡観察を行う。また、神経系細胞でのみAtg5をノックアウトするマウスを用いて、TRPV1刺激が疼痛閾値に如何なる影響を与えるのかに関しても解析予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
効率的な調達の結果として残金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の細胞実験および動物実験に使用する試薬や動物の購入に充当する予定である。
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