| 研究実績の概要 |
H28年度の研究計画に従い、下記の実験を行った。一定の成果が得られた。
1)行動薬理学実験でAMPKとTRPの関係およびAMPKの疼痛制御を確認した。AMPKのactivatorやinhibitorをラットの足底に注射し、capsaicinやAITCによる痛み行動に対する影響を侵害受容性行動（plantar test, Von Frey test法）で評価した。AMPKの活性化変化は疼痛行動を影響することが確認された。
2)AMPK活性化によるTRPチャネルの細胞内の局在調節とそのメカニズムを検討した。TRPチャネル強制発現したHEK細胞とDRG細胞を用いて、AMPKのactivatorやinhibitorをアプライし、細胞内TRPA1とTRPV1の局在変化を下記の方法で検討した。①膜タンパクにおける発現量をWestern Blotを用いて定量した。②蛍光標識したTRPA1プラスミドをHEK細胞に導入し、共焦点レーザー顕微鏡でその動態を観察した。③細胞外TRPA1ドメインを認識する抗体を用いて、細胞膜のTRPA1発現変化を調べた。結果、AMPKのactivatorはHEK細胞とDRG細胞に発現するTRPA1とTRPV1のトータルタンパクへの影響はなかった。膜タンパクはTRPV1の変化がなかったが、TRPA1は有意に変化することが確認された。
3)TRPA1とTRPV1細胞内ドメインのAMPKバインディングサイトとリン酸化サイトを同定した。リン酸化部位を同定するため，AMPKによるリン酸化モチーフをもとにアミノ酸配列を検索し、TRP細胞内ドメインのAMPKによるリン酸化モチーフの多く存在する領域さらにこの領域に存在するリン酸化サイトの同定を免疫沈降法で試みた。結果、AMPKとTRPチャネルのバインディングが確認できなかった。
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