| 研究課題/領域番号 |
26460885
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
原 正昭 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (50129160)
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| 研究分担者 |
永井 淳 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00207961)
田村 明敬 大阪医科大学, 医学部, 助教 (50207239) [辞退]
山本 敏充 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50260592)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 蚊 / STR / 個人識別 / 吸血経過時間推定 / DNA定量 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、大日本除蟲菊(株)中央研究所の協力で、吸血が完全に消化される３日間の吸血・生存・殺虫方法が検討され、最終的に以下のとおり、アカイエカ及びヒトスジシマカにより実施された。すなわち、人工飼育された蚊を一匹ずつ、透明な円形プラスチックカップに入れ、薄手のパンストで覆い、パンスト部分を各被験者の腕に当て、蚊がパンストを通して十分吸血した段階で、腕からそのカップを離し、そのままパンスト部を、ショ糖溶液で湿らせたガーゼ片にかぶせ、設定された経過時間後に、そのカップをジエチルエーテルで飽和したビニール袋内に入れ殺虫した。直ちに、実体顕微鏡写真を撮影後、1.5 mLチューブに入れて、各採取チューブをドライアイスボックスに入れ凍結する方法で、被検者数、予備実験２名、本実験５名の計７名で行った。
凍結した各吸血蚊試料からキアゲン社のQIAamp MicroキットによりDNA抽出した。各抽出DNA試料を、KAPA Human Genomic DNA Quantification and QC Kitによる３種類の増幅長（41 bp, 129 bp, 305 bp）の異なるプライマーによるDNA定量を行い、その結果、129 bp/41 bp, 305 bp/41 bpの定量値比を算出した。また、各抽出DNA溶液１μLを鋳型として、ライフテクノロジー社のIdentifiler plusキットを用いて、15座位のSTR及び性別判定用のアメロゲニンを増幅し、キャピラリー電気泳動後、型判定を行った。その結果、型判定は吸血後２日経過まで可能で、また、得られた定量値、定量値比、型判定数、ピーク高比から総合的に判断して半日単位の経過時間推定が可能であることが示唆された。しかしながら、ヒトスジシマカでは、ある程度、被験者間の差のない安定した結果が得られたが、アカイエカでは、吸血後、半日程度までの間に、吸血をほぼ全て放血してしまうような現象が見られた。今後は、例数を増やすことにより、さらに精度の高い吸血後経過時間推定が可能であると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度、多少時間を要したが、研究遂行にあたり、一番重要課題であった当大学及び各研究機関の倫理委員会の承認を得ることができ、また、大日本除蟲菊(株)中央研究所との間で共同研究契約を締結し、研究協力体制を確立できたことで、本年度、実際の実験を実施することが可能になった。その間にも、具体的な吸血方法、吸血後の一定経過時間までの生存方法、及び殺虫方法も検討がなされ、さらには、危惧されていた被験者の獲得も順調に進み、８月上旬に２名の被験者による吸血予備実験、並びに８月下旬には、５名の被験者による吸血本実験を行うことができた。
その後、９月の１ヶ月で、全ての全ての吸血蚊試料から、キアゲン社のQIAamp DNA MicroキットによるDNA抽出、KAPA社のHuman Genomic DNA Quantification and QC KitによるDNA定量、並びに、ライフテクノロジー社のIdentifiler plusキットによる15座位のSTR型判定及びアメロゲニン座位の性別判定を実施し、本年度予定されていたDNA解析を全て行うことができた。また、得られたDNA定量値及びサイズの異なる増幅長断片の定量値比、並びに、15座位のSTR型判定とアメロゲニン座位の性別判定数及びそれらのピーク高比から、半日単位の推定ではあるが、吸血後の経過時間推定が可能となった。このことは、吸血後24時間経過以前の消化初期におけるDNA分解の程度を調べる新たな方法論の開発など方法論的に多少の改良・修正の余地はあるものの、今後、本研究を行う方法論がほぼ確立できたことを意味しており、本年度の研究は、本研究を遂行する上で、大きな進展であったといえよう。現在、これらの結果をまとめ、英語論文作成中で、近々外国誌に投稿を予定している。
従って、アカイエカにおける放血の生態系での実態の検討など、本年度実験を行わなければ、知りえなかった課題は残されているものの、ほぼ順調に研究が進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度である本年度は、昨年度本実験を一度行い、本研究を行う方法論がほぼ確立でき、ある程度の結果が得られたので、国内あるいは国際学会での発表を予定している。また、現在、作成中である英語論文、外国誌に投稿を予定である。しかしながら、今年度、もう一度10名程度の被験者で、吸血の本実験を行う予定をしており、それ以前に、昨年度行われた吸血の本実験で課題となった、吸血後24時間経過以前の消化初期におけるDNA分解の程度を調べる新たな方法論の開発、並びに、アカイエカで吸血後半日程度までの間に、吸血をほぼ全て放血してしまうような現象の実態についてなどの検討が必要であると考えられる。前者は、現在のところ、増幅断片長が約2 kbp、1.5 kbp、1 kbp、500 bpになるようなヒトのある特定部位のPCR産物が、高分子DNAでは、同じ増幅量になるようなマルチプレックスPCRシステムを開発することで克服できると考え、現在そのプライマー設計･PCR条件の検討などを行っているので、本実験前に開発できる予定である。後者においては、アカイエカの生体を用いた観察が可能である、大日本除蟲菊(株)中央研究所において、検討されているので、本実験は、その原因あるいは実態がわかった段階で、吸血実験の改良点を検討した後に、本実験を行う予定である。また、吸血後の経過時間についても、初期の段階は、あまり消化しないと考えられたので、被験者の負担を軽減するために、12時間経過以前は、０、２、４、６、８、12時間経過で十分であると考えられた。今年度は、吸血本実験をこのような改良点を加えて、昨年度と同様の吸血実験を10名程度の被験者により実施する予定である。また、全実験の抽出DNA試料について、STR型判定にMinifilerキット及びMidi-6システムを、さらに男性由来DNA試料には、Yfilerキットを用いて追加解析を行い、最終年度として、本研究のまとめを行い、最終的な成果発表を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品購入の節約ができたため（43千円）
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| 次年度使用額の使用計画 |
消耗品購入（電気泳動関連試薬）に使用する。
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