2015 年度実施状況報告書

大腸癌におけるコリバクチン産生性大腸菌の病原性の検討とスクリーニング法の開発

研究課題

研究課題/領域番号	26460962
研究機関	東京大学
研究代表者	吉田俊太郎東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70598713)
研究分担者	平田喜裕東京大学, 医学部附属病院, 助教 (10529192)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード	大腸癌 / 腸内細菌 / 大腸菌
研究実績の概要	H26年度は、当院の倫理委員会の審査を経て大腸検査施行時の腸管洗浄液を採取し、大腸菌の培養、細菌DNAの抽出を行い、PCR法によってコリバクチン遺伝子(clbB)の陽性大腸菌株を分離した。pks genotoxic island遺伝子群の別の遺伝子(clbA, clbQ遺伝子)についても陽性であることを確認した。細菌DNAは、qPCRで細菌数、大腸菌数、コリバクチン陽性大腸菌数の半定量を開始した。 H27年度は、前年度に引き続き腸管洗浄液を収集し、腸内細菌DNAの検討を進めた。現在までに110例よりインフォームドコンセントを取得し腸管洗浄液からDNAを抽出した。現在のところ約35％の症例でclbB遺伝子陽性であり、pks陽性大腸菌の保有率も同程度と考えている。疾患別にコリバクチン陽性率を検討したところ、大腸癌40例中14例　35%、大腸腺腫45例中18例　40%とほぼ同程度であった。炎症性腸疾患では5例中1例　20%であった。病変を認めない正常コントロールのDNAでは20例中9例　45%と腺腫、大腸癌症例とほぼ同程度であった。現在さらなる症例数の蓄積と、pks陽性大腸菌の相対菌量との関係などの解析を加えている。またpks genotoxic island遺伝子群のなかのclbP遺伝子産物は、コリバクチンの活性に影響をおよぼすと報告されている。我々は患者より単離した7株のpks陽性大腸菌(UT009SC, UT060SC, UT063SC, UT081SC, UT126SC, UT158SC, UT186SC)について1515bpのclbP遺伝子の配列決定を行った。結果6株はリファレンス遺伝子(K12 substrain. MG1655)と完全一致であったが、UT081SC株でVal (385) > Ala(385)　の変異があることが分かった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由現時点までに腸管洗浄液中の糞便DNAからpks陽性細菌をPCRで検出し、半定量を行うスクリーニング法を確立した。100例を超える腸管洗浄液DNAにおいて大腸癌、大腸腺腫の有無とpks遺伝子の有無について解析を開始している。またpks陽性大腸菌を単離し、その生物学的特徴について実験を始めている。
今後の研究の推進方策	大腸癌およびコントロールの症例を増やしてさらに腸管洗浄液と抽出DNAを採取し、また臨床情報を統合してコリバクチン陽性大腸菌と大腸癌の関係の解析を行う。コリバクチン陽性大腸菌の病原性を明らかにするためにコリバクチン陽性大腸菌とそのノックアウト大腸菌もしくは、コリバクチン陰性大腸菌を培養細胞株に感染させ、アポトーシスやサイトカインの発現などを測定し、コリバクチン遺伝子が宿主の上皮細胞に与える影響を検討する。一方、血清を用いたスクリーニング法の開発目的でリコンビナントClbB蛋白の精製をGST融合蛋白の作成を行う。リコンビナントClbB蛋白が精製できれば患者血清を用いてpks陽性大腸菌の保有の有無をELISAで検討できるか研究を進める。