| 研究課題/領域番号 |
26460967
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
松浦 稔 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30402910)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 炎症性腸疾患 / Ngal |
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| 研究実績の概要 |
炎症性腸疾患(Inflammatory Bowel Disease；以下IBD)の病態形成には様々な環境因子が関与する。中でも鉄は腸内細菌叢のバランスや細菌の毒性変化を介してIBDの病態に関与することが報告されている。一方、好中球や消化管上皮などに発現がみられるNeutrophil gelatinase-associated lipocalin (Ngal)は細菌による鉄利用を阻害して生体防御に働くことが知られているが、IBDの病態への関与は不明である。そこで、IBD動物モデルとして腸内細菌の存在下に慢性腸炎が自然発症するInterleukin-10欠損(以下IL-10KO)マウスを用いて、1) 腸管組織におけるNgalの発現とNgal発現細胞の同定、2) 糞便中のNgal濃度と炎症腸管の組織学的活動度(Histologic score)との相関、3) Ngal発現を誘導する因子について検討した。その結果、1) 野生型マウス(コントロール群)と比較して、IL-10KOマウスの腸管組織におけるNgalの遺伝子発現は有意に増強し、かつ腸炎の進展とともに経時的に増加した。2) 免疫染色による検討ではIL-10KOマウスの大腸組織におけるNgalの発現は主として腸管上皮細胞であった。3) IL-10KOマウスの糞便中Ngal濃度は経時的に増加し、Histologic scoreと有意な正の相関を示した。4) マウス腸管上皮細胞株(CT26)を用いた検討ではIL-1b、IL-17、TLR4 ligandによる刺激でCT26細胞からのNgal産生が有意に増強した。さらにIL-1bやIL-17に対する中和抗体およびTLR4/IL-10 double KOマウスを用いた検討にて、これらの因子によるNgal発現誘導効果をin vivoでも確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度当初の研究計画では、IBD動物モデル(IL-10KOマウス)を用いてNgalの経時的発現と腸内細菌への影響についての検討する予定であった。現在、IL-10KOマウスの腸管組織におけるNgalの発現や発現細胞の同定、またNgal発現を誘導する因子についての検討は、当初の計画通りほぼ順調に推移しているが、腸内細菌への影響に関する解析が進んでいない。これについては分子生物学的解析(T-RFLP解析など)を予定しているが、サンプル調整に必要な試薬や解析費用が高価であるため、少数例の検体での解析は経費的な観点から望ましくなく、解析予定の検体を大量に集めて一度に解析する必要がある。従って、現時点では解析に必要なサンプル調整の段階でとどめており、今後、検体数が集まり次第、順次、解析に進めていく予定である。また、本年度の計画ではIBDの病態へのNgalの関与とそのメカニズムを解明するため、IL-10KO/Ngal double KO(IL-10/Ngal DKO)マウスを作製して、Ngalを欠損させることによる腸炎への影響を検討開始する予定であった。現在、IL-10KO/Ngal DKOマウスの作成には既に成功しているが、予想以上にマウス交配後の出生数や出生後生存率が低いことが判明したため、これらのマウスを用いた解析がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度も当初に計画した研究実施計画に基づいて解析を進めていく。
１）腸炎モデルの作成とその解析： IL-10KO/Ngal DKOマウスを作成し、Ngalが慢性腸炎と腸内細菌に与える影響を検討する。また腸管粘膜の防御機能に対するNgalの影響を検討するため、代表的な粘膜傷害モデルであるデキストラン硫酸(DSS)腸炎をNgal KOマウスに誘導し、その解析を行う。
２）慢性腸炎および疾患感受性におけるNgalの影響についての検討： 上記の各モデルマウスにおいて腸管組織および腸間膜リンパ節細胞を経時的(4, 6, 8週齢)に採取し、組織学的腸炎ならびに炎症性サイトカインの発現を比較検討する。また、腸内細菌への影響についての解析するため、マウスの盲腸内容物から細菌のgenomic DNAを抽出し、T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)解析や代表的なcolitogenic bacteriaやprotective bacteriaに特異的なprimerを用いて定量的PCRを行い、腸内細菌叢の変化を検討する。
３）腸炎におけるNgalの病態への関与とそのメカニズムの検討： Ngalが腸管上皮細胞で主に発現されることやIL-10KO/Ngal DKOマウスの出生後生存率が低いことから、Ngalは自然免疫機構や粘膜防御機能に関与する可能性が考えられる。したがって、腸管組織における粘膜防御関連因子(Claudin, ZO-1, MUC2, TTF, MDR-1など)の発現やマクロファージを用いたin vitroでの検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は当初の研究計画で予定していた腸内細菌に関する解析が進んでいない。これについては分子生物学的解析を予定しているが、サンプル調整に必要な試薬や解析費用が高価であるため、少数例の検体での解析は経費的な観点から望ましくない。従って、効率的な経費使用のため、解析予定の検体を大量に集めて一度に解析する必要があり、現時点では解析に必要なサンプル調整の段階でとどめており、今年度は上記の解析費用が発生しなかった。加えて、本年度に予定していた新たな動物モデル(IL-10KO/Ngal double KOマウス)の解析についても、現在、モデルマウスの作製が完了した段階であり、これらの解析に要する経費が低く抑えられた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の研究遂行に必要とされる経費は、1）実験マウスの飼育・管理、2）各種抗体および試薬、3）情報収集および成果発表のための旅費である。
1) 実験マウスの飼育・管理に要する費用： 新たな実験モデルマウスの作成・維持に加え、経時的な解析やex vivoでの検討が必要であり、通常より多めの実験マウスの維持管理が必要となる。2) 各種抗体および試薬： これまでと同様、病理組織学的解析やサイトカイン測定に必要な試薬・抗体の購入が必要である。また今後は分子生物学的手法を用いた腸内細菌の解析を本格化するため、これらに関する経費が新たに必要となる。3）情報収集および成果発表のための旅費： 本研究に関する情報収集および成果発表のための旅費が必要になる。
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