CRISPR/Cas9系を用いた大腸炎自然発症マウスの原因遺伝子領域の同定と解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26460972
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 入江 厚 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 講師 (30250343)
• 研究分担者: 今村 隆寿 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 准教授 (20176499) ; 竹田 直樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (90304998)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 潰瘍性大腸炎 / HLA-DR / CRISPR/Cas9システム / トランスジェニックマウス / 疾患モデル動物

研究実績の概要

本研究は申請者らが作製したHLA-DR4トランスジェニックマウスのホモ接合体が、重篤な潰瘍性大腸炎様の症状を呈し、生後３～４ヶ月以内に死亡する原因を突き止めることを目的とする。これまでにHLA-DR4トランスジーンは第３染色体のテロメア側に、約39kb塩基長の欠落を伴い挿入されていることを明らかにしている。
本マウスに見られる大腸炎発症がトランスジーンのホモ接合体のみに認められることから、この病因は、第３染色体の39kb塩基領域の欠損か、あるいはHLA-DR4分子の過剰発現か、あるいはその両方であることが考えられた。39kb塩基領域の欠損が病因である可能性を検討するため、CRISPR/Cas9システムを用いて人為的に同領域をノックアウトしたマウスを作製し、本トランスジェニックマウスと同様の症状を呈するか否かを確認する。いっぽう、HLA-DR4分子の過剰発現が病因である可能性は、導入したトランスジーンによるHLA-DR4分子の発現に不可欠なMHCクラスIIトランスアクチベーター（CIITA）を欠損するマウスと本トランスジェニックマウスを交配することにより、CIITA欠損背景のホモ接合体マウスを作製し、二倍体量のトランスジーンと39kb塩基領域の欠損は保持するがHLA-DR4分子を発現しないマウスを作製し、本トランスジェニックマウスと同様の症状を呈するか否かで確認する。
本年度は、上記第３染色体約39kbを欠損するマウスの作製、およびCIITA欠損マウスと本トランスジェニックマウスとの交配を開始し、前者については５系統のキメラマウスを作製し、第３染色体約39kbを欠損が安定して子孫に伝わることを確認した。後者については、現在CIITA欠損およびトランスジーンの両ホモ接合体マウスを作製中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、HLA-DR4トランスジーンの挿入により生じた第３染色体の約39kbの欠損を人為的に再現するため、同領域をネオマイシン耐性遺伝子と置換する相同組換ベクターを作製し、CRISPR/Cas9システムを用いて従来法よりも置換効率を高めることにより相同組換体を樹立する研究計画であった。当該相同組換ベクターは予定通り作製できたが、意図した相同組換が生じたES細胞は１クローンしか得られず、さらに同ES細胞から作製したキメラマウスは精子形成が不全であり、相同組換体遺伝子を子孫に伝えることができなかった。
そこでCRISPR/Cas9システムにより直接的に第３染色体約39kbの除去を試みたところ、5つのES細胞クローンが得られ、そのうち４つのクローンからキメラマウスを作製することができた。さらにそのうちの３系統のマウスにおいて、改変遺伝子が安定して子孫に伝達されることを確認した。これらのF1マウス間の交配、あるいはF1マウスとヘテロ接合体マウスとの交配により、第３染色体約39kbを欠損するマウスを繁殖させ、それらの表現型を観察中である。
また次年度以降に計画していたCIITA欠損背景のHLA-DR4トランスジェニックマウスの作製にも着手し、現在交配により、CIITA欠損およびトランスジーンの両ホモ接合体を繁殖させている。
したがって、研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

CRISPR/Cas9システムにより作製した第３染色体約39kbを欠損するマウス、およびCIITA欠損背景のトランスジーンホモ接合体マウスが、それぞれトランスジーンホモ接合体マウスに観察される大腸炎を発症するかどうかを、目視、体重変化、病理解剖、大腸浸潤細胞の解析等を行い、大腸炎発症の病因を検討する。また、骨髄移植実験、MHCクラスⅡやIL-6の欠損マウスとの交配などを行い、大腸炎発症の原因となる細胞や分子機構の特定を進める予定である

研究成果

• [雑誌論文] Identification of immunogenic LY6K long peptide encompassing both CD4+ and CD8+ T-cell epitopes and eliciting CD4+ T-cell immunity in patients with malignant disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomita Y, Yuno A, Tsukamoto H, Senju S, Kuroda Y, Hirayama M, Imamura Y, Yatsuda J, Sayem MA, Irie A, Hamada A, Jono H, Yoshida K, Tsunoda T, Daigo Y, Kohrogi H, Yoshitake Y, Nakamura Y, Shinohara M, Nishimura Y
  • 雑誌名: Oncoimmunol. 巻: 3 ページ: e28100
  • DOI: 10.4161/onci.28100
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of CDCA1-derived long peptides bearing both CD4+ and CD8+ T-cell epitopes: CDCA1-specific CD4+ T-cell immunity in cancer patients. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tomita Y, Yuno A, Tsukamoto H, Senju S, Yoshimura S, Osawa R, Kuroda Y, Hirayama M, Irie A, Hamada A, Jono H, Yoshida K, Tsunoda T, Kohrogi H, Yoshitake Y, Nakamura Y, Shinohara M, Nishimura Y
  • 雑誌名: Int J Cancer 巻: 134 ページ: 352-366
  • DOI: 10.1002/ijc.28376
  • 査読あり
• [雑誌論文] S-guanylation proteomics for redox-based mitochondrial signaling. (2014)
  • 著者名/発表者名: Rahaman MM, Sawa T, Ahtesham AK, Khan S, Inoue H, Irie A, Fujii S, Akaike T
  • 雑誌名: Antioxid Redox Signal 巻: 20 ページ: 295-307
  • DOI: 10.1089/ars.2012.4606
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Novel HLA-DR4 transgenic mice that develop sever colitis and pneumonia with serious defects in lymphoid organs (2014)
  • 著者名/発表者名: Irie, A., Michibata, Y., Kubo, T., Imamura, T., Takeda, N., Araki, K., Sasaki, G., Shibuya, I., Sogo, S., and Nishimura, Y.
  • 学会等名: 第43回日本免疫学会学術集会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-12-10 – 2014-12-12
• [学会発表] HLA-DR4トランスジェニックマウスのホモ接合体のリンパ組織形成不全と大腸炎および肺炎の発症 (2014)
  • 著者名/発表者名: 入江 厚、道端 弥生、久保 多津子、今村 隆寿、矢津田 旬二、竹田 直樹、荒木 喜美、江藤 正俊、澁谷 功、十河 真司、西村 泰治
  • 学会等名: 第23回日本組織適合性学会大会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2014-09-13 – 2015-09-15