研究実績の概要 |
1.新たなHCVレプリコン増殖細胞の作成:ネオマイシン耐性遺伝子とルシフェラーゼリポーター遺伝子の融合遺伝子を発現するキメラリポーターHCVレプリコン(Rep-Feo)RNAをHuh7細胞に導入し,G418選択によりFeoレプリコン恒常発現細胞株を(Huh7/Rep-Feo)を樹立した。細胞株樹立の確認には、細胞から抽出した蛋白をもとにルシフェラーゼアッセイを行った。 2.HCVレプリコンHuh7/Rep-Feo細胞については、HCVジェノタイプ1bと2aの2種類を作成することができた。レプリコンRNAは、northern blottingにて確認し、ウイルス蛋白発現はwestern blottingよりHCV非構造蛋白NS5A蛋白の存在にて確認した。 3.インターフェロン誘導遺伝子(ISG)発現プラスミドベクターの構築:Human Liver cDNA library発現プラスミドを用いて,PCR法により遺伝子を増幅し,ISG発現プラスミドベクターを構築した。構築したISG:IP10, IL8, MxA,PKR,GBP-1,IFI-56K,25OAS,IFP35,IRF-9,IFI-6-16,ISG15,IFI-27,PLSCR1,TRAIL,LMP7-E,9-27,RIG-G,IRF-1。それぞれのプラスミドベクターを培養細胞へ遺伝子導入したあと、細胞から蛋白抽出して、western blottingを行って、それぞれの蛋白発現を確認した。 4.ISG発現ベクターをHCVレプリコン細胞へ遺伝子導入し、HCV増殖への影響を解析したところ、IRF-1の他、GBP-1,IFI-6-16,IFI27発現にて、HCV増殖抑制が有意に認められた。さらにISG発現ベクターをHCV感染培養細胞へ導入したところ、IRF-1,GBP-1,IFI-6-16,IFI27発現にてHCV増殖抑制が認められた。
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