自然免疫活性化によるB型肝炎ウイルス特異的T細胞応答の誘導

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461015
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 五十川 正記 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50723201)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: B型肝炎ウイルス / HBV特異的CD8+T細胞 / 活性化樹状細胞

研究実績の概要

B型肝炎ウイルスはエンベロープで覆われた不完全二本鎖DNAウイルスであり、急性または慢性肝炎の原因となり、B型慢性肝炎の多くは肝硬変、さらには肝細胞癌へと進行する。HBVの排除には感染細胞を選択的に破壊することの出来るHBV特異的CD8+T細胞応答が必要不可欠である。実際、HBV特異的CD8+T細胞はB型急性肝炎患者の末梢血中には多数存在し、抗ウイルス作用の要となるインターフェロンガンマ(IFN-γ)産生能を有する。一方で、B型慢性肝炎患者の末梢血中ではHBV特異的CD8+T細胞数は著明に減少し、ほとんどの場合でIFN-γ産生能の低下が認められる。従って、機能的なHBV特異的CD8+T細胞応答の誘導が、B型慢性肝炎の治療の一環として重要と考えられているが、そのようなT細胞応答がどのような機序で誘導されるのかは明らかにされていない。
申請者らの研究から、HBV 特異的T細胞が肝細胞表面に提示された抗原を認識することにより、それらの機能が抑制されること、さらに、特殊抗原提示細胞である樹状細胞を活性化することにより、この機能抑制を解除できるということが示された。
本研究は、活性化樹状細胞が、どのような分子学的機序でHBV特異的免疫寛容を克服し、機能的なHBV特異的T細胞応答の誘導するのかを明らかにするとともに、機能的HBV特異的T細胞応答を誘導するために効果的な自然免疫シグナル伝達経路を同定することを目的とする。これらの研究は、自然免疫の活性化がどのようにHBV特異的T細胞応答の誘導につながるのかを解明するのみならず、B型慢性肝炎に対する新しい免疫治療の開発を促進するものと期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成27年度は骨髄由来細胞による抗原提示が、HBV特異的T細胞応答の誘導に十分であるかを検討するため、肝臓内でHBVを発現するHBVトランスジェニックマウス(HBV-Tgマウス)をMHC class Iを発現しないβ2-マイクログロブリン(β2m) 欠損マウスと交配し、MHC class Iを実質細胞上に発現しないHBV-Tgマウスを作成した。これらのマウスにX線照射を施し、野生型のB6マウスから単離した骨髄細胞を移入し、骨髄由来細胞上でのみMHC class Iを発現する骨髄キメラHBV-Tgマウスを作成した。これらのマウスをαCD40で刺激し、HBV特異的CD8+T細胞受容体を発現するT cell receptor (TCR)トランスジェニックマウス(TCR-Tgマウス)から単離したCD8+T細胞を養子移入し、レシピエント中のHBV特異的CD8+T細胞応答を解析した。HBV特異的CD8+T細胞は、骨髄由来細胞のみでMHC class I を発現するHBV-Tgマウスにおいても、野生型HBV-Tgマウスとほぼ同程度、活性化の指標であるCD69を発現していた。このことは骨髄由来細胞が肝細胞で産生されたHBVを取り込み、外因性抗原提示機序により、HBV特異的CD8+T 細胞を活性化することを示している。このような活性化にもかかわらず、HBV特異的CD8+T 細胞は骨髄由来細胞のみでMHC class I を発現するHBV-Tgマウスにおいては全く増殖せず、IFN-γ産生能や細胞傷害能といった機能分化も示さなかった。以上の結果から、骨髄由来細胞による抗原提示は機能的HBV特異的CD8+T 細胞応答の誘導に十分でなく、肝細胞による抗原提示が細胞の増殖と機能分化、特に細胞傷害能の誘導に必須であることが示された。

今後の研究の推進方策

これまでにHBV特異的CD8+T細胞応答誘導における肝細胞と骨髄由来細胞による抗原提示の相対的重要性を検討した結果、肝細胞による抗原提示が骨髄由来細胞による抗原提示よりも重要な役割を果たすことが明らかとなった。しかしながら、これらの結果はHBVに対して免疫寛容状態にあるHBV-Tgマウスにおける結果であり、肝臓であらたに産生されたHBVに対する免疫応答を反映しない可能性もある。そこで平成28年度は、HBVに暴露されていないマウスにおいて、肝細胞と骨髄由来細胞による抗原提示がHBV特異的CD8+T細胞応答の誘導にどの程度重要であるかを検討する。実質細胞もしくは骨髄由来細胞のみでMHC class I を発現するマウスに、HBV特異的TCRを発現するTCRトランスジェニックマウスから単離したCD8+T細胞を養子移入し、HBVの全長の1.24倍長の遺伝子を組み込んだプラスミドをハイドロダイナミックインジェクション法を用いて肝臓内に導入することによりHBV複製を誘導し、その後HBV特異的T細胞応答を経時的に解析する。一方で、Type 1 IFN、IL-12などを介した第３シグナルが、機能的HBV特異的CD8+T細胞応答の誘導に重要性であるかどうかを検討する。具体的には、HBV-Tgマウスを抗IFN-α/β受容体抗体 (αIFN-α/βR) (Clone MAR1-5A3)、抗IL-12抗体 (αIL-12) (clone C17.8)にてそれぞれのシグナルを阻害し、同マウスのDCsをαCD40で刺激後、HBV特異的ナイーブCD8+T細胞を養子移入する。養子移入7日後にHBV特異的CD8+T細胞応答、HBV複製・mRNA発現、肝障害の程度を解析する。さらに、CD40のみでなく、各種toll like receptors (TLRs)に対するアゴニストやretinoic acid-inducible gene 1 like receptor (RLR)に対するアゴニストを用いて自然免疫経路を活性化し、機能的なHBV特異的CD8+T細胞応答が誘導されるかを検討する。

次年度使用額が生じた理由

27年度は高額な試薬の購入がなく、マウスの飼育に関しても効果的に行えた。さらに、当該研究費からの旅費支出も不要であった。

次年度使用額の使用計画

28年度は研究開始3年目となり、研究成果の論文発表を予定しており、高額な消耗品の購入も計画している。さらに実験動物飼育費も増加すると見込んでおり、繰越し研究費を加えることで研究の成果向上を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Host genetic variants influencing the clinical course of Hepatitis B virus infection. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsuura K, Isogawa M, Tanaka Y.
  • 雑誌名: J Med Virol. 巻: 88(3) ページ: 371-9
  • DOI: 10.1002/jmv.24350.
  • 国際共著
• [雑誌論文] Host-virus interactions in hepatitis B virus infection. (2015)
  • 著者名/発表者名: Guidotti LG, Isogawa M, Chisari FV.
  • 雑誌名: Curr Opin Immunol. 巻: 36 ページ: 61-6
  • DOI: 10.1016/j.coi.2015.06.016.
  • 国際共著
• [雑誌論文] Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8(+) T cells. (2015)
  • 著者名/発表者名: Guidotti LG, Inverso D, Sironi L, Di Lucia P, Fioravanti J, Ganzer L, Fiocchi A, Vacca M, Aiolfi R, Sammicheli S, Mainetti M, Cataudella T, Raimondi A, Gonzalez-Aseguinolaza G, Protzer U, Ruggeri ZM, Chisari FV, Isogawa M, Sitia G, Iannacone M.
  • 雑誌名: Cell 巻: 161(3) ページ: 486-500
  • DOI: 10.1016/j.cell.2015.03.005.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Characterization of novel entecavir resistance mutations. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Murakami S, Omagari K, Matsui T, Iio E, Isogawa M, Watanabe T, Karino Y, Tanaka Y.
  • 雑誌名: J Hepatol. 巻: 63(3) ページ: 546-53
  • DOI: 10.1016/j.jhep.2015.03.020.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Novel 4'-modified nucleoside analogs exert antiviral replication against hepatitis B virus with drug resistance mutations (2016)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Takamatsu Y, Maeda K, Murakami S, Omagari K, Matsui T, Isogawa M, Watanabe T, Karino Y, Kohgo S, Mitsuya H, Tanaka Y
  • 学会等名: 25th Conference of the Asian Pasific Association for the Study of the Liver (APASL2016)
  • 発表場所: International Convention Center Pamir, Tokyo, Japan
  • 年月日: 2016-02-20 – 2016-02-24
  • 国際学会
• [学会発表] Host and viral determinants for differential hepatitis B virus clearance between genotypes (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawashima K, Isogawa M, Tsutsumi S, Murakami S, Saito S, Nakajima A, Tanaka Y. 25th Conference of the Asian Pasific Association for the Study of the Liver (APASL2016), 2016/2/
  • 学会等名: 25th Conference of the Asian Pasific Association for the Study of the Liver (APASL2016)
  • 発表場所: International Convention Center Pamir, Tokyo, Japan
  • 年月日: 2016-02-20 – 2016-02-24
  • 国際学会
• [学会発表] Clearance rate of hepatitis B virus differs between genotypes in association with CD8+ T cell activation in the liver. (2015)
  • 著者名/発表者名: Isogawa M, Kawashima K, Tsutsumi S, Murakami S, Tanaka Y
  • 学会等名: 第63回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡
  • 年月日: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [学会発表] Identification of a flavonoid derivative that directly acts on hepatitis B virus surface protein and inhibits viral entry. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Hamada Y, Isogawa M, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Saito A, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T
  • 学会等名: 第63回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡
  • 年月日: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [学会発表] Endogenous antigen presentation by hepatocytes plays an essential role in the induction of HBV-specific CD8+ T cell responses (2015)
  • 著者名/発表者名: Isogawa M, Murata Y, Kawashima K, Tanaka Y
  • 学会等名: The 66th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD2015)
  • 発表場所: Moscone West Convention Center, San Francisco, USA
  • 年月日: 2015-11-13 – 2015-11-17
  • 国際学会
• [学会発表] Hepatocellular carcinoma-associated core N51H mutation enhances infectivity of hepatitis B virus genotype F1b by facilitating dimerization of the core protein (2015)
  • 著者名/発表者名: Hayashi S, Khan A, Ogawa K, Kawashima K, Simons B, Jones C, Homan C, McMahon B, Murakami S, Iijima S, Isogawa M, Watanabe T, Tanaka Y
  • 学会等名: 2015 International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • 年月日: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • 国際学会
• [学会発表] Differential hepatitis B virus clearance between genotypes is correlated with HBV-specific CD8+T cell responses in the liver (2015)
  • 著者名/発表者名: Kawashima K, Isogawa M, Tsutsumi S, Murakami S, Saito S, Nakajima A, Tanaka Y
  • 学会等名: 2015 International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • 年月日: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • 国際学会
• [学会発表] Comparison of cytopathic and non-cytopathic antiviral effects of interferon alpha and lambda against hepatitis B virus infection. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsutsumi S, Watanabe T, Kawashima K, Murakami S, Isogawa M, Tanaka Y
  • 学会等名: 2015 International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Dolce Bad Nauheim, Germany
  • 年月日: 2015-10-04 – 2015-10-08
  • 国際学会
• [学会発表] 新規エンテカビル耐性株の同定とその特徴 (2015)
  • 著者名/発表者名: 林佐奈衣, 村上周子, 尾曲克己, 松居剛志, 飯尾悦子, 五十川正記, 渡邊綱正, 狩野吉康, 田中靖人
  • 学会等名: 第51回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: ホテル日航熊本、熊本県
  • 年月日: 2015-05-21 – 2015-05-22
• [学会発表] 肝細胞による内因性抗原提示と樹状細胞による外因性抗原提示がHBV特異的CD8＋T細胞応答に及ぼす相対的役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 五十川正記, 村田泰洋, 田中靖人
  • 学会等名: 第51回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: ホテル日航熊本、熊本県
  • 年月日: 2015-05-21 – 2015-05-22
• [学会発表] 異なるHBV遺伝子型間で認められるHBV抗原遷延化率の違いと肝臓内CD8＋T細胞応答の相関性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河島圭吾, 五十川正記, 松波加代子, 堤進, 村上周子, 渡邊綱正, 斉藤聡, 中島淳, 田中靖人
  • 学会等名: 第51回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: ホテル日航熊本、熊本県
  • 年月日: 2015-05-21 – 2015-05-22