研究課題
これまでの我々の知見では慢性閉塞性肺疾患（Chronic obstructive pulmonary disease; COPD）患者の疫学的調査により、免疫細胞の遊走における中心的な役割を演じるとされる Chemokine (C-C motif) ligand の一つであるCCL1の遺伝子多型 (NCBI: rs2282691)がCOPD患者における気道感染性および生命予後を支配する重要な因子であることを発見した。この遺伝子多型は転写因子の親和性に差をもたらすことが示され、当SNP A-alleleではCCL1の発現量が減弱しているものと推定された。Surfactant protein C promoterを用いて肺特異的にCCL1を過剰発現するCCL1 transgenic マウス（SPC-CCL1 Tgマウス）を作製した。SPC-CCL1 TgマウスにBacille de Calmette et Guérin（BCG）気管内投与を行い感染モデルを作製し、肺における病態を評価した。また、DNA microarray解析を用いてこれらのマウスの肺における遺伝子発現を検討した。顕微鏡的観察では、SPC-CCL1 Tg マウスで有意に肉芽腫の増加を認めた。また肺間質における炎症は抑制されていた。DNA microarray解析では、SPC-CCL1 Tgマウスは野生型に比べ、“生物的ストレスに対する応答”に関連するタグをもつ47の遺伝子で顕著な発現増加を認め、小胞体ストレスと肉芽腫形成に重要な役割を果たしているErn1が野生型に比べSPC-CCL1 Tgマウスで発現が亢進していた。CCL1の過剰発現は、肺BCG感染時に肉芽腫形成を増加させた。Ern1はこの肉芽腫形成促進に重要な役割を演じている可能性が示された。
2: おおむね順調に進展している
当年度においては、遺伝子改変マウスを用いて肺内に炎症を惹起し、野生型マウスとの炎症の病態形成に差があるかを組織学的および遺伝子レベルでの解析を行った。DNA microarray解析により生物学的ストレスに対する応答に関連する遺伝子の発現に差を認めたことから、CCL1の遺伝子発現が炎症性肺疾患の形成に何らかの関与をしていることが明らかになった。今後遺伝子発現に差を認めた因子の機能解析や、他の炎症性疾患のモデルを作成することで、CCL1の肺における機能を明らかにしていく計画である。
＜CCL1過剰発現が実験間質性肺炎モデルに及ぼす影響の検討＞ 肺特異的CCL1発現マウスおよびコントロールマウスに対し、代表的な間質性肺炎のモデルとして知られるブレオマイシン気管内投与を行い、間質性肺炎を誘導する。Ａ．DNA microarray解析：抽出したtotal RNAに対して、DNA microarray解析による網羅的な遺伝子発現変化の解析を委託にて行う。Ｂ．肺組織：線維化の定量評価：作成したHE標本を光学顕微鏡を用い、肺組織障害の程度を定量評価する。さらに、エラスチカマッソン染色や免疫染色にて、細胞外マトリックス成分の量や分布の変化を観察する。Ｃ．呼吸機能検査：ブレオマイシン投与後にマウス呼吸機能に変化を生じているかどうかを、呼吸機能測定システム（Buxco Research Systems）にて評価する。肺活量、0.1秒量、静肺コンプライアンスを評価指標とする。＜DNA microarray解析から得られた網羅的遺伝子発現データの検証＞Ａ．microarray解析によって発現の差が認められた遺伝子（候補遺伝子）について、肺組織から得られたmRNAを用いてRT-PCRを行い、遺伝子発現の定量化を行う。Ｂ．肺組織中から採取されている蛋白を用いて、microarray解析で差が認められた因子につきWestern blottingを用いて蛋白発現の差を検討する。Ｃ．培養細胞を用いた検討：候補遺伝子が主に発現している細胞を、文献的にかつ免疫組織染色所見を基に判定する。その細胞に相当する培養細胞を用いて候補遺伝子の機能を解析する。
予算は計画通りほとんど使用しているが、端数となる額が残金として残りました。
次年度に消耗品の購入で使用する計画です。
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10.7150/ijbs.8737
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