| 研究課題/領域番号 |
26461163
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
門田 淳一 大分大学, 医学部, 教授 (50233838)
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| 研究分担者 |
平松 和史 大分大学, 医学部, 准教授 (80301381)
橋永 一彦 大分大学, 医学部, 病院特任助教 (80649773)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 緑膿菌 / 線毛 / 樹状細胞 / ワクチン / 呼吸器感染症 |
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| 研究実績の概要 |
Balb/cマウスの大腿骨をPBSでフラッシュし、骨髄液を採取し、骨髄細胞を得る実験を実施した。当初は目標としていた2000000個／mLの骨髄細胞が十分に得られなかったが、手技の習熟により効率化、時間短縮することで、骨髄細胞を予定の細胞数確保することが可能となった。得られた骨髄細胞をGM-CSFで培養し、細胞を回収してフローサイトメトリを用いてCD11c陽性細胞であることの確認実験を昨年度に引き続き行った。細胞の分化が高効率となる条件を探るために、培養液中のGM-CSFの濃度と培養日数を変更し検討したところ、GM-CSFの濃度は20ng/mL、培養日数は8日間が最も良好であったが、この条件下で得られた細胞はCD11c陽性細胞が50-60％程度と目標とする90％以上には至っていない。
平成28年度もショ糖濃度勾配超遠心法およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、線毛蛋白の精製を行った。線毛蛋白に少量混入しているLPSを除去するために、エンドトキシン除去カラムを用いてLPSの除去を行っているが、線毛蛋白を蒸留水に溶解したものをエンドトキシン除去カラムに通した場合、線毛蛋白の喪失が非常に多いことが問題となった。その原因として、ポリミキシンBと線毛蛋白とにイオン的な非特異的結合が生じている可能性を疑い、溶媒に炭酸水素アンモニウム溶液や塩化ナトリウム溶液を用いたが、線毛蛋白の喪失は依然多かった。このことから、線毛蛋白とLPSとが強固に結合している可能性が考えられた。この結合の解除を目的に、線毛蛋白の溶媒として界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウム溶液を溶媒として用いて検討を行った。デオキシコール酸ナトリウム溶液の濃度を調整して検討すると、0.5%の濃度において、線毛蛋白の回収率とLPSの除去効率が良好であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マウス大腿骨骨髄細胞から、当初想定していた効率でCD11c陽性細胞が得られていない。またエンドトキシン除去カラムを用いた緑膿菌線毛蛋白からのLPSの除去が難航したため、LPS除去済みの緑膿菌線毛蛋白の精製が遅れている。緑膿菌線毛蛋白のアミノ酸配列の一部であるペプチド6（TFQTGTSSPKNATKVITLNR）および精製線毛蛋白刺激樹状細胞投与による急性緑膿菌肺炎マウスモデルを用いた感染抑制効果の検討について平成28年度に実施予定であった。しかしながらCD11c陽性細胞の樹立やLPS除去済みの緑膿菌線毛蛋白の精製が遅れたこともあり、マウスへの抗原刺激した樹状細胞の投与による感染制御効果の実験が十分に行われていない。さらに緑膿菌慢性気道感染症マウスモデルに対する樹状細胞投与効果の検証も行えていないため、「遅れている」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス大腿骨骨髄細胞からのCD11c陽性細胞を、より高効率に得る条件の設定を引き続き行う。エンドトキシン除去カラムを用いたLPS除去済みの緑膿菌線毛蛋白の精製を引き続き行う。ex vivoにおいて緑膿菌線毛蛋白ペプチドあるいは精製線毛蛋白で刺激した樹状細胞の急性緑膿菌肺炎マウスモデルに対する感染防御効果について検討を行う。また慢性気道感染症マウスモデルにおける緑膿菌線毛蛋白ペプチドおよび精製線毛蛋白刺激樹状細胞の感染予防効果についても検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
高い純度でのCD11c陽性細胞の樹立やエンドトキシン除去カラムを用いた緑膿菌線毛蛋白からのLPSの除去が難航したため、平成28年度に予定していた緑膿菌線毛蛋白ペプチドあるいは精製線毛蛋白刺激樹状細胞のマウスへの移入および急性・慢性感染マウスモデルを用いた実験を実施できなかった。そのためマウスや一部の試薬の購入を行わなかったため、次年度使用額が生じた。また平成28年度に行った実験は平成27年度に購入した試薬を使用することで実施できたため、平成28年度に使用する予定であった金額が次年度使用額となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度も引き続き線毛蛋白の精製を行う。そのために必要な試薬を購入する。また樹状細胞をマウス大腿骨骨髄細胞から作成するためのマウス購入やGM-CSFの購入を予定している。緑膿菌線毛蛋白ペプチドあるいは精製線毛蛋白刺激樹状細胞の移入、感染実験を行うためのマウスの購入や試薬の購入を行う。
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