| 研究課題/領域番号 |
26461179
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
横山 知行 群馬大学, 保健学研究科, 教授 (70312890)
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| 研究分担者 |
松井 弘樹 群馬大学, 保健学研究科, 講師 (20431710)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | Elovl6 / 肺気腫 / 飽和脂肪酸 / 不飽和脂肪酸 |
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| 研究実績の概要 |
II型肺胞上皮より産生される肺サーファクタントは約9割が脂質で構成され、肺胞の虚脱を防ぐとともに、外敵からの生体防御に重要な役割を果たしているが、肺胞上皮の脂質代謝と呼吸器疾患の関係は明らかになっていない。そこで、肺胞上皮での飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のバランスに着目し、肺胞上皮細胞の脂肪酸組成を制御するStearoyl-CoA desaturase-1(SCD1)とElongation of long chain fatty acid member 6 (Elovl6)の発現と呼吸器疾患進展との関係をSCD1、Elovl6遺伝子欠損マウスを用いて明らかにすることを目的に研究を開始した。大変興味深いことに、Elovl6欠損マウスでは間質の線維化だけでなく、肺胞の破壊による気腫性変化も伴っていた。特に体重の少ないマウスで肺気腫病変の進行が著しかった。また、弾性線維の断裂を認めたが、膠原線維には変化は認めなかった。一方、Elovl6欠損マウスの肺ではアポトーシスが認められ、アポトーシスに関連してBaxおよびBcl-2遺伝子発遍の上昇も認められた。さらに、この肺から脂質を抽出し、脂肪酸分画を測定したところ、飽和脂肪酸であるパルミチン酸の増加、不飽和脂肪酸であるオレイン酸の減少を認めた。次に、野生型マウス2ヶ月の長期喫煙曝露を負荷して肺気腫モデルを作製したところ、非喫煙マウスに比較して、喫煙マウスの肺胞上皮でElovl6蛋白の発現増加を認めた。さらに、この肺気腫モデル肺の脂肪酸分画を測定すると、パルミチン酸の減少とオレイン酸の増加を認め、肺線維症モデルとは逆の結果となった。また、この肺気腫モデルマウスの気管支肺胞洗浄液（BAL洗浄液）中細胞成分ではElovl6,Elovl6,SCD1,FATP1 mRNA発現の増加も確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
群馬大学では平成26年に動物実験施設の大幅な改修工事が行われたため、半年以上に渡って、動物実験、特に遺伝子改変動物による動物実験が困難な状況にあった。平成27年より生物資源センターとして動物実験が可能となるも、遺伝子改変動物の飼育再開にあたっては動物のクリーニングが必要であり、Elovl6欠損マウス、SCD1欠損マウスのクリーニングを行った。さらにコンディショナルノックマウスの作製にあたって、自然受精が成功せず、人工授精による繁殖を開始した。従って、本研究の主要課題である遺伝子改変動物による実験が当初の計画より遅延している。
（１）SCD1、Elovl6欠損マウスを用いて、肺気腫の病態モデル動物を作製し、肺でのSCD1、Elovl6活性および脂肪酸組成の変化と病態との関係を比較検討する。
野生型マウス2ヶ月の長期喫煙曝露を負荷して肺気腫モデルを作製したところ、非喫煙マウスに比較して、喫煙マウスの肺胞上皮でElovl6蛋白の発現増加を認めた。さらに、この肺気腫モデル肺の脂肪酸分画を測定すると、パルミチン酸の減少とオレイン酸の増加を認めた。また、この肺気腫モデルマウスの気管支肺胞洗浄液（BAL洗浄液）中細胞成分ではElovl6,Elovl6,SCD1,FATP1 mRNA発現の増加も確認した。
（２）II型肺胞上皮特異的にSCD1発現あるいはElovl6発現を欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作成して、II型肺胞上皮の脂肪酸組成バランスと病態との関係を検討する。
Elovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、Elovl6をloxP遺伝子で挟んだElovl6 floxマウスを作製し、現在、繁殖中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）SCD1、Elovl6欠損マウスを用いて、肺気腫の病態モデル動物を作製し、肺でのSCD1、Elovl6活性および脂肪酸組成の変化と病態との関係を比較検討する。
1) Bligh and Dyerの方法に従って肺組織から脂質を抽出し、組織中の遊離脂肪酸分画をガスクロマトグラフィー法にて測定することで、局所におけるSCD1、Elovl6活性を求める。2) 肺組織からmRNAおよびタンパクを抽出し、SCD1、Elovl6およびSP-Cの発現と、肺気腫や肺線維症のマーカーとなる遺伝子群（MMP-2, 9、TGF-β、IL-6など）を定量的PCR法やELISA法にて比較検討する。3) 肺胞上皮の障害を検討するため、アポトーシス（TUNEL法、caspase3活性で検出）、ROS産生（oxidant-sensitive fluorogenic probes 5-(and 6)-chloromethyl-2’,7’- dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl esterで検出）を同定する。
（２）II型肺胞上皮特異的にSCD1発現あるいはElovl6発現を欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作成して、II型肺胞上皮の脂肪酸組成バランスと病態との関係を検討する。
II型肺胞上皮特異的SCD-1およびElovl6ノックアウトマウスに（１）と同様に肺気腫モデルを作製する。このようにして作製したマウスを用いて（１）と同様な実験を行い、II型肺胞上皮でのSCD1およびElovl6発現と脂肪酸組成バランスが肺気腫の発症、進展に重要であることを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
群馬大学では平成26年に動物実験施設の大幅な改修工事が行われたため、半年以上に渡って、動物実験、特に遺伝子改変動物による動物実験が困難な状況にあった。平成27年より生物資源センターとして動物実験が可能となるも、遺伝子改変動物の飼育再開にあたっては動物のクリーニングが必要であり、Elovl6欠損マウス、SCD1欠損マウスのクリーニングを行った。さらにコンディショナルノックマウスの作製にあたって、自然受精が成功せず、人工授精による繁殖を開始した。従って、本研究の主要課題である遺伝子改変動物による実験が当初の計画より遅延しているため、研究費の使用も一部、平成28年度に繰り越しとなっている。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Elovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、Elovl6をloxP遺伝子で挟んだElovl6 floxマウスを作製し、現在、繁殖中である。このコンディショナルノックアウトマウスを作成して、II型肺胞上皮の脂肪酸組成バランスと病態との関係を検討する予定であり、繰り越しとなった研究費を用いて、当初の予定通りの実験を実施していく。また、これらの研究によって得られた成果を国内および国際学会にて発表する予定である。
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