悪性中皮腫における薬剤耐性の克服と分子標的治療の開発

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461183
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 関根 郁夫 筑波大学, 医学医療系, 教授 (10508310)
• 研究分担者: 田川 雅敏 千葉県がんセンター研究所, 細胞治療開発研究部, 部長 (20171572) ; 岩澤 俊一郎 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (00527913) ; 瀧口 裕一 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30272321)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 悪性中皮腫 / 薬剤耐性 / 増殖因子 / ペメトレキセド / インシュリン様増殖因子

研究実績の概要

悪性中皮腫に対する治療薬として、シスプラチンとペメトレキセドの併用が第一選択薬として使用されているが、同薬剤に耐性となった症例では効果的な第二選択薬が知られておらず、この状況はここ10年以上も変わっていない。そこで当該抗がん剤の耐性克服は同疾患の予後改善にとって重要な課題である。本研究ではペメトレキセド耐性機構の一端を解明し、その耐性克服の糸口を検討しようとした。まずヒト悪性中皮腫細胞のペメトレキセド耐性株を、コロニー形成能を指標に樹立した。この耐性株はWST法においても細胞傷害活性が低下し、親株と網羅的に遺伝子発現を比較したところ、6遺伝子が、耐性株で上昇していた。そこで、当該蛋白質が実際に耐性株で増加しているかをウエスタンブロット法で検討したところ、ANKRD1とIGFBP3分子に発現上昇が見られた。そこで同分子の薬剤耐性における関与についてsiRNAを用いて検討したところ、ANKRD1分子の発現減少によっても、ペメトレキセド耐性は変化しなかった。一方、siRNAよるIGFBP3分子の発現低下は、3種類のsiRNAのいずれにおいても、薬剤耐性細胞におけるペメトレキセド耐性を増加させたが、親株における同薬剤耐性に影響を与えなかった。この結果は、IGFBP3分子の薬剤耐性における関与を示唆するも、発現上昇が同薬剤耐性に関連していないことを意味している。そこで、IGFBP3分子の発現に関してエライザ法を用いて検討したところ、薬剤耐性細胞では同分子の分泌が実は低下しており、siRNA処理によって、さらに分泌量は低下した。一方、細胞内部のIGFBP3は親株に比較して増加していた。すなわち、薬剤耐性細胞ではIGFBP3分子の分泌傷害によって細胞外分子の量が低下しており、それを補正するため産生量（細胞内蛋白量）が増加したと想定された。また、IGFBP3分泌の減少は増殖因子であるIGFの当該受容体への結合性を増加させ、薬剤感受性を減少させたと考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

薬剤耐性の関与する6候補遺伝子の中で、実際に蛋白質として発現上昇していたのは2種類であり、siRNA処理で薬剤感受性に影響を与えたのはIGFBP3分子のみであった。したがって、候補分子のスクリーニングは順調に実施しえた。ただし、発現量の増加が薬剤耐性を結びつくと想定していたが、実際は予想に反して、IGFBP3分子の分泌量が耐性株で観察され、しかもsiRNA処理によって、一層薬剤耐性が高まっていた。しかも、親株ではなく耐性株においてのみ、この薬剤耐性の増強が観察された。IGFBP3分子の機能は複雑で、IGFの当該受容体への結合を阻害する一面、それを促進することも知られている。現時点においては、IGFBP3はIGF機能を阻害すると考え、IGFBP3の減少は増殖刺激を向上させ、細胞代謝阻害剤の効果を抑制したと考えている。親株は一定以上のIGFBP3が産生されており、siRNA処理による影響を受けなかったと思われる。一方薬剤耐性株における蛋白質の増加は、分泌量は低下したものの細胞内分子量は増加したためであろう。薬剤耐性株においてはIGFBP3分泌が傷害された点については、splice異常あるいは前駆体からの分解が阻止されていた可能性がある。事実ウエスタンブロット法において、薬剤耐性株のIGFBP3分子量は、親株のそれより高分子量に泳動されていた。

今後の研究の推進方策

IGFBP3分子の薬剤耐性に関与する機構については、当該分子が薬剤耐性を増強するとするものと、抑制するという2種類の報告が知られている。本研究成果は後者の可能性を示唆している。これはIGFBP3分子そのものが分泌蛋白であり、細胞外において作用するからである。そこで、組換えIGFBP3を細胞外から投与して、薬剤耐性が変化するかどうかを検討する予定である。ただし、細胞内IGFBP3が増殖因子シグナル系に影響を与える可能性は否定しえない。一方、ペメトレキセドの薬剤耐性はAMPKの活性化に関与するという論文が最近公表された。そこで、当該細胞でもこれを検討すると、薬剤耐性細胞でリン酸化AMPK分子の発現が親株に比較して上昇していた。そこで、AMPKからmTOR経路のおける薬剤耐性における関与につても、検討をする予定である。

次年度使用額が生じた理由

薬剤耐性株のsiRNA処理実験、またウエスタンブトット法による検討が順調に進行したため、薬剤耐性の関与する6候補遺伝子の検討を少ない費用で行うことができた。結果は、6候補遺伝子の中で実際に蛋白質として発現上昇していたのは2種類のみであったため、4候補遺伝子についてはその後の検討を省くことができたため、予算よりもやや少ない使用額となった。

次年度使用額の使用計画

上記の通り当初想定した結果とは異なる実験結果が得られたが、研究費用の多少の余裕が生じたため、遺伝子組換えIGFBP3分子を購入して、同分子の薬剤耐性における悪性中皮腫細胞における作用を検討する。一方、もしこの作用が確認された場合は、同遺伝子の発現ベクターを作成して、これをされに確認する予定である。またAMPK-mTOR経路の検討を実施する。上記研究計画のため、細胞培養関係の物品、その他抗体等の一般生化学試薬、遺伝子組換え用の分子生物学的試薬を購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] An intrapleural administration of zoledronic acid for inoperable malignant mesothelioma patients: a phase I clinical study protocol. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tada, Y., Hiroshima, K., Shimada, H., Shingyoji, M., Suzuki, T., Umezawa, H., Sekine, I., Takiguchi, Y., Tatsumi, K. and Tagawa, M.: An intrapleural administration of zoledronic acid for inoperable malignant mesothelioma patients: a phase I clinical study protocol
  • 雑誌名: SpringerPlus 巻: 5 ページ: 195-202
  • DOI: 10.1186/s40064-016-1893-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A clinical protocol to inhibit the HGF/c-Met pathway for malignant mesothelioma with an intrapleural injection of adenoviruses expressing the NK4 gene. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tada, Y., Hiroshima, K., Shimada, H., Morishita, N., Shirakawa, T., Matsumoto, K., Shingyoji, M., Sekine, I., Tatsumi, K. and Tagawa, M.
  • 雑誌名: SpringerPlus 巻: 4 ページ: 358-368
  • DOI: 10.1186/s40064-015-1123-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular-targeted therapy for malignant mesothelioma (2015)
  • 著者名/発表者名: Tada, Y., Suzuki, T., Shimada, H., Hiroshima, K., Tatsumi, K. and Tagawa, M
  • 雑誌名: Pleura 巻: 1 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1177/2373997515600403
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 悪性中皮腫細胞に対してHSP90 阻害剤はAKT とMDMX 活性を阻害し、Nutlin-3a と相乗的な抗腫瘍効果を示す (2015)
  • 著者名/発表者名: 李知瀚、岡本慎也、盛永敬郎、江媛媛、久保秀司、関根郁夫、滝口裕一、多田裕司、巽浩一郎、島田英昭、廣島健三、田川雅敏
  • 学会等名: 第74回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（名古屋）
  • 年月日: 2015-10-08 – 2015-10-10