肺上皮細胞のリプログラミング法の開発

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461185
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 齋藤 朗 東京大学, 保健・健康推進本部, 助教 (90591412)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 転写因子 / 遺伝子導入 / 三次元培養 / 動物モデル

研究実績の概要

肺の器官形成における遺伝子発現制御の階層性を明らかにすべく、公共データベースを活用して解析を進めた。具体的にはFANTOM5で提供されているマウス肺のCAGEデータや、GEOで公開されているマイクロアレイのデータセットを活用した。自己組織化マップ・クラスタリングなどの手法で、各発生段階において特徴的なgene signatureを抽出した。さらにテキストマイニングの手法も併せ、リプログラミングの鍵となりうる転写因子数十個を選定した。
染色体に組み込まれず自己複製が可能なエピソーマルベクターによる遺伝子導入法を試みていたが、導入効率と細胞生存率の低さが制約であった。これを解決するためネッパジーン社のスーパーエレクトロポレーター NEPA21の活用を試みた。EGFP発現ベクターを用いて、iPS細胞、肺上皮細胞株、肺線維芽細胞株への遺伝子導入効率を、フローサイトメーターと蛍光顕微鏡での観察によって評価し、電圧・パルス幅など条件検討を行った。
分化誘導培地として肺上皮細胞用の無血清培地を使用することが簡便であり、その分化誘導活性は分化マーカーの発現変化によって確認している。分化誘導の初期段階では細胞生存が妨げられるが、細胞選択という視点からはむしろ有用かもしれない。間葉系細胞との共培養や三次元培養・air-liquid interfaceについては、コラーゲンゲルを用いた実験系を構築している。さらにMACSを活用したマウス肺胞上皮細胞の分離培養法も導入しII型肺胞上皮細胞の培養に成功した。
将来的な治療応用や疾患モデルでの活用を視野に入れると、分化誘導させた細胞が個体に生着するか否かを確認することが肝要である。ブレオマイシンによる肺傷害モデルや、片肺切除による肺再生モデルが進められている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

遺伝子発現ベクターの構築や遺伝子導入の最適化に時間がかかっている。

今後の研究の推進方策

複数の遺伝子の効率的な発現誘導を得るためにCRISPR/Cas9のシステムの導入を検討している。

次年度使用額が生じた理由

研究進捗の遅れのため

次年度使用額の使用計画

新規の実験系の構築のための消耗品などの購入（分子生物学・生化学実験試薬など）

研究成果

• [雑誌論文] Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction. (2015)
  • 著者名/発表者名: Horie M, Saito A, Yamaguchi Y, Ohshima M, Nagase T.
  • 雑誌名: J Vis Exp. 巻: 96 ページ: NA
  • DOI: 10.3791/52469.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Smad3 and TTF-1/NKX2-1 complex regulates Smad4-independent gene expression. (2014)
  • 著者名/発表者名: Isogaya K, Koinuma D, Tsutsumi S, Saito RA, Miyazawa K, Aburatani H, Miyazono K.
  • 雑誌名: Cell Res. 巻: 24(8) ページ: 994-1008
  • DOI: 10.1038/cr.2014.97.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. (2014)
  • 著者名/発表者名: Horie M, Saito A, Yamauchi Y, Mikami Y, Sakamoto M, Jo T, Nakajima J, Takizawa H, Nagase T, Kohyama T.
  • 雑誌名: Exp Lung Res. 巻: 40(5) ページ: 222-236
  • DOI: 10.3109/01902148.2014.900155.
  • 査読あり
• [雑誌論文] An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. (2014)
  • 著者名/発表者名: Noguchi S, Saito A, Horie M, Mikami Y, Suzuki HI, Morishita Y, Ohshima M, Abiko Y, Mattsson JS, König H, Lohr M, Edlund K, Botling J, Micke P, Nagase T.
  • 雑誌名: Clin Cancer Res. 巻: 20(17) ページ: 4660-4672
  • DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-3328.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel swine model of transfusion-related acute lung injury. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okazaki H, Ishikawa O, Iijima T, Kohira T, Teranishi M, Kawasaki S, Saito A, Mikami Y, Sugiura A, Hashimoto S, Shimada E, Uchikawa M, Matsuhashi M, Tsuno NH, Tanaka M, Kiyokawa N, Fujimoto J, Nagase T, Tadokoro K, Takahashi K.
  • 雑誌名: Transfusion. 巻: 54(12) ページ: 3097-3107
  • DOI: 10.1111/trf.12766.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Differential knockdown of TGF-β ligands in a three-dimensional co-culture tumor- stromal interaction model of lung cancer. (2014)
  • 著者名/発表者名: Horie M, Saito A, Noguchi S, Yamaguchi Y, Ohshima M, Morishita Y, Suzuki HI, Kohyama T, Nagase T.
  • 雑誌名: BMC Cancer. 巻: 14 ページ: 580
  • DOI: 10.1186/1471-2407-14-580.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] エピソーマルベクターを用いた肺上皮細胞へのダイレクトリプログラミングの試み (2014)
  • 著者名/発表者名: 堀江 真史，齋藤 朗，野口 智史，長瀬 隆英
  • 学会等名: 第35回日本炎症・再生医学会
  • 発表場所: 沖縄
  • 年月日: 2014-07-01 – 2014-07-04