| 研究課題/領域番号 |
26461196
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
太田 洋充 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (40451562)
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| 研究分担者 |
萩原 弘一 埼玉医科大学, 医学部, 客員教授 (00240705)
海老名 雅仁 東北薬科大学, 大学病院, 呼吸器センター長 (10280885)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 薬剤性肺障害 / ムチン / びまん性肺胞上皮障害 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトの切除肺からの気道上細胞初代培養を試みた。当初、切除肺から気管を分離し、上皮細胞を剥離し、プロテアーゼ処理し、細かく切り刻み細胞懸濁液を作成し、コラーゲンでコートした容器で培養したが、作成効率が悪かった。そのため、切除肺の気管支をブラシで擦過し細胞を回収したところ、高率に気道上皮細胞の初代培養細胞を得ることができるようになった。同時に、MUC4のVNTR部分のクローニングとシークエンスを行った。southern blottingにより、VNTRの大きさを同定した。制限酵素処理した場合、MUC4のVNTR部分にの長さは個人差が大きかったが、薬剤性障害を持つ患者は約20000のバンドを共通して持っていた。また、VNTR分部のクローニングを試みた。当初はBiotion probeを用いて、VNTR分部を回収することを目指した。しかし、十分な量を回収することができず、long PCR用のtaqを使用し、18000～20000塩基のPCR産物を生成、さらに相同組み換えを利用した、クローニングキットを使用し、VNTR分部のクローニングに成功した。さらに、クローニングしたプラスミドを、Fragmentaion Kitを使用し、1000～2000塩基程度に裁断し、TAベクターに回収。回収したベクターを大腸菌に導入しコロニーを形成させた。48～96コロニーを回収、それぞれをシークエンスし、複数を組み合わせることにより、VNTR部分の全長のシークエンスを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
気道上皮細胞の初代培養細胞は、1週間程度の培養で、senesenceに陥ってしまい、このままの状態では、細胞障害実験等に使用できないことが判明した。また、ヒト切除肺を使用し、MUC4の発現細胞を同定する予定であったが、倫理委員会への申請に手間取り、実際にヒトの肺検体での検討が行えていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
MUC4のVNTR部分のシークエンス、及びクローニングが完了したため、次にMUC4の発現ベクターを作成を開始する。また、気道上皮細胞の初代培養細胞にｈTERTをレンチベクター等により導入し、安定し培養できる細胞株を作成する。新たに病理医に協力を仰ぎ、MUC4の発現細胞の検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
MUC4のVNTR部分のクローニングに難渋し、発現ベクターの作成に至らなかった。また、患者のMUC4のVNTR部分のシークエンスを行うことができたが、対象となる健常人のシークエンスとの比較が不完全で、MUC4の遺伝子多型が完全に同定できておらず、薬剤耐性試験やMUC4遺伝子多型による機能の変化については、実験をすすめることが出来なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在、MUC4 VNTR部分のクローニングは完了しており、発現ベクターの作成を行う。また、患者のMUC4 VNTRと比較すべき、非患者のMUC4 VNTRのシークエンスの解析を進め、MUC4の遺伝子多型のうち、びまん性肺障害と関連の深い遺伝子多型の同定を進める。
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