| 研究課題/領域番号 |
26461203
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
寺崎 美佳 日本医科大学, 医学部, 助教 (50372785)
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| 研究分担者 |
寺崎 泰弘 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50332870)
三宅 弘一 日本医科大学, 医学部, 准教授 (90267211)
漆山 博和 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20725303) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | サバイビン / 非腫瘍性肺疾患 / 再生 / 炎症急性期 |
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| 研究実績の概要 |
I:マウス肺疾患病態モデルでのサバイビンの発現動態のin vivoの解析において、ブレオマイシン肺障害モデルの他、LPS肺障害モデル、高濃度酸素暴露肺傷害モデルなどにても肺胞上皮細胞主体にサバイビン発現が増加することを確認し、肺胞洗浄液蛋白濃度の上昇、MMP2,MMP9上昇、SP-D増加との相関を認めた。凍結肺組織においてもサバイビンおよびactive-caspase3上昇が蛋白およびmRNAレベルで確認されアポトーシスとの関連も示唆された。
II: 培養肺（上皮）細胞での傷害モデルで、サバイビンの発現を遺伝子操作して抑制や亢進の調節をした際の傷害効果をみるin vitro検討において、マウス肺胞上皮培養細胞であるMLE-12において、ブレオマイシンによる傷害を来すとヒトの肺胞上皮培養細胞と同様にマウスサバイビンの発現が増加することを確認した。また、マウス肺胞上皮培養細胞にリポフェクタミンおよびウィルスベクターによるshRNAを使った遺伝子操作でサバイビン発現を抑制すると、著しく細胞増殖が抑えられ、細胞数が減少し、ヒトの肺胞上皮培養細胞でsiRNAを用いてサバイビン発現を抑制した場合と同様であった。
I, IIを通して、肺炎症性疾患におけるサバイビン発現は、より急性期にみられ、ヒト、マウス、培養細胞で普遍的にみられる現象であることが示唆された。サバイビン抑制は、細胞増殖を著明に低下させ、また、アポトーシスも促進され、結果細胞死へと至らせることから、サバイビン発現は急性炎症期の細胞再生、増殖、アポトーシスに関わること考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
急性期、慢性期炎症の再生過程にサバイビンが関与しているとの仮定の下、研究を進めているが、ヒト肺組織の検討や、マウス傷害モデル肺組織の検討、培養細胞を用いた検討により、特に急性期での細胞再生、増殖に関与していると考えられた。培養細胞を用いたサバイビン抑制実験では、著しい細胞増生の抑制と、傷害物質に対する細胞の脆弱性が確認されたが、予想していたよりもサバイビン抑制による細胞増殖抑制がみられ、再生後の細胞増生にサバイビンが寄与している可能性が強く、さらに抑制系の詳細な検討が必要である。当初、サバイビン抑制が強すぎた場合に培養細胞が生存しない現象がおこり、検討が困難であったが、長期のsiRNAであるshRNAをもちいた抑制系では細胞生存が可能で有り、抑制系のさらなる検討を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はサバイビンのin vivoでの機能を明らかにするため、 現在マウスブレオマイシン肺障害においてサバイビンの発現を抑制した場合のin vivoでの効果を、サバイビンshRNAとアデノ随伴ウィルスベクター（AAV）を用い検討する導入準備として感染するとGFPでラベルがされるコントロールアデノ随伴ウィルスベクター（AAV）をマウス注射し、４週後の肺における感染細胞の確認を抗GFP抗体により可視化して行い、肺上皮細胞への感染、遺伝子導入を確認している。
また、in vivoでの肺でのサバイビン抑制および亢進系を検討可能にする為、特にマウス肺に集積する４型のアデノ随伴ウィルスを用いサバイビンshRNA導入したAAVベクターを構築中である。
作製したサバイビンshRNA 導入した4型AAVベクターをブレオマイシンモデルマウスの尾静脈より静注し、in vivoにおいてサバイビンの発現抑制や亢進を調節し、マウスブレオマイシン障害肺モデルでの傷害の差異の比較解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ベクター作成、導入の予備実験に時間がかかっている。培養細胞でのサバイビン抑制系の機能解析は進んでおり、亢進系の解析および予定のマウスにAAVベクターを用いてin vivoにてサバイビンを抑制、亢進させる実験のため、今後試薬、遺伝子解析等にコストがかかると思われる。また海外の学会への参加を見合わせたため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
in vivoでの詳細なサバイビン発現のメカニズムを明らかにするため、サバイビンshRNAをAAVベクターを用いて種々の傷害モデルマウスに導入し、サバイビン抑制・亢進を調節した傷害効果の比較検討のための物品に使用する計画である。また、今年度は国内外の学会への参加費用として使用する予定である。
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