| 研究課題/領域番号 |
26461244
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
市田 公美 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (80183169)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 尿酸トランスポーター / GLUT9/SLC2A9 / ABCG2 / 高尿酸血症 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、尿酸トランスポーター変異体の尿酸輸送能を検討し、痛風・高尿酸血症発症における各尿酸トランスポーター異常の関与の程度などの詳細を解明する。本年度は、①ABCG2の尿酸輸送評価系の構築 及び②高尿酸血症患者におけるSingle Nucleotide Polymorphism（SNP）の同定を目的とした。
①ABCG2の尿酸輸送評価系の構築
ヒト胎児腎由来HEK293細胞にABCG2をコードする遺伝子ベクターをトランスフェクションし、細胞膜画分を抽出した。さらに吸引吐出により膜反転した反転膜小胞に尿酸を添加し、インキュベートを行った。反応終了後に洗浄を行い、小胞を溶解して溶解液中の尿酸量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量評価した。前年度において、ABCG2を発現していないmock小胞と尿酸輸送量に有意差が見られないことが問題となっていた。本年度は、反応終了時の洗浄条件及び小胞溶解液組成の検討を行った。結果、ABCG2を発現する小胞において、mock小胞よりも有意に高い尿酸輸送量を認めた。また、これまでに尿酸輸送能低下が報告されているABCG2 Q141K変異体を発現する反転膜小胞についても同様に実験を行い、野生型ABCG2よりも尿酸輸送量が低下することを確認した。よって、反転膜小胞を用いたABCG2の尿酸輸送評価系を構築できたと結論した。
②高尿酸血症患者におけるSNPの同定
本研究では、高尿酸血症患者100例において、遺伝子GLUT9/SLC2A9、NPT1/SLC17A1、NPT4/SLC17A3、OAT2/SLC22A7、PDZK1、OAT3/SLC22A8 のそれぞれにつき、全コーディング領域のシークエンス解析を計画している。その前段階として、本年度は、GLUT9/SLC2A9の全コーディング領域を分割し増幅するPCR条件を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ABCG2尿酸輸送評価系構築については目的を達成したが、高尿酸血症患者におけるSNPの同定では、シークエンス解析の前段階にとどまった。理由として、前年度にABCG2の尿酸輸送評価系構築には至らなかったことを受け、本年度においても継続して検討を行ったことがある。本事項については、前年度終了時に立てた方策に基づき適切な条件検討を行ったことにより、検出能の向上を図り、目的を達成することができた。次年度においては、高尿酸血症患者におけるSNPの同定を継続して行う。尿酸トランスポーターのシークエンス解析において実績を持つ連携研究者である松尾洋孝と連携をとることで、迅速な解析を実施できると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
高尿酸血症患者100例におけるSNPの同定を行う。遺伝子GLUT9/SLC2A9、NPT1/SLC17A1、NPT4/SLC17A3、OAT2/SLC22A7、PDZK1、OAT3/SLC22A8 のそれぞれにつき、全コーディング領域のシークエンスを行う。これによりアミノ酸置換を引き起こす非同義置換SNPs（nsSNP）を同定すると同時に、頻度を明らかにする。さらに、NCBI のdbSNP データベース及びJSNP データベース上のSNPs と比較し、日本人における頻度が明らかなものは、高尿酸血症症例に高頻度に認めるか検討する。同定したnsSNPの変異体をコードする遺伝子ベクターを作製し、そこから合成したcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に導入する。変異体を発現した卵母細胞に14C標識尿酸を添加し、取り込まれた尿酸量を定量することにより変異体の尿酸輸送能を検証する。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた尿酸輸送評価系については、平成26年度に構築済みである。
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