小胞輸送異常に着目したパーキンソン病の分子病態解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461263
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 長谷川 隆文 東北大学, 大学病院, 講師 (70361079)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 異常蛋白伝播 / プリオン仮説 / パーキンソン病 / 多系統萎縮症 / αシヌクレイン / シヌクレイノパチー / 小胞輸送 / ESCRT

研究実績の概要

遺伝性・孤発性神経変性疾患において、病変部位における異常凝集タンパク沈着は病理学的指標であるばかりでなく、神経細胞死につながる重要なステップと考えられている。プリオン仮説は、PD患者脳におけるLewy病理のtopographic progressionとも論理的整合性を有する。一方、プリオン病と神経変性疾患の間には症状進行スピードや病理学的進展パターンの点で大きな隔たりがある。実際、分子・細胞レベルでみても変性疾患関連タンパクとプリオンの挙動には相違点が多く、個々の凝集性タンパクの生化学的特性、タンパクの高次構造、あるいは細胞のストレス状況によっても伝播機構が異なる可能性が指摘されている。故に、それぞれの凝集性タンパク毎に分泌・吸収・分解機構を精緻に解明することが今後の治療応用を考える上で不可避である。我々は異常タンパク伝播の背景にある膜輸送・小胞輸送系に着目し、PD 患者脳内に蓄積する凝集化αシヌクレインの吸収・分泌・分解に関与する小胞輸送経路を詳細に検討してきた。これらの研究を通じ、(1) αシヌクレイン分泌はプリオンとは異なり、リサイクリングエンドソーム経路が主要ルートであること、(2) 高分子オリゴマー・fibrillar αシヌクレインの吸収はエンドサイトーシスが担う一方、低分子可溶性オリゴマー・モノマーαシヌクレインは細胞膜の直接貫通により細胞内へ移行すること、(3) 細胞内に取り込まれたαシヌクレイン分解には、リソソーム・オートファジー機能が重要であること、(4) 内在化αシヌクレインはE3 リガーゼNEDD4によるK63ユビキチン化によりエンドソームにソーティングされることなど、複数の重要な知見を世界に先駆けて報告した（Sugeno et al., JBC 2014、Miura et al., Neurobiol Dis 2014）。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

CaMKII-Creを用い前脳特異的 ESCRT-0/Hrs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)欠損マウス（CaMKII-Cre::Hrsマウス）の作製に成功した。同マウスは加齢に伴い運動障害が誘発され、生後8週以内に全例が死亡した。病理組織学的検討では海馬CA1・CA3を中心にユビキチン・p62陽性の凝集蛋白蓄積、および難溶性αシヌクレイン・Huntingtin・TDP-43蓄積を伴う神経細胞脱落を確認した。さらに同マウス脳組織では酸化ストレスマーカー（8OHdG）蓄積とp38 SAPKシグナル活性化が生じていることも確認した。また、ESCRT-0/Hrs KO PC12細胞では、細胞内αシヌクレイン蓄積とともにオートファゴソームとリソソームの癒合障害によるautophagic fluxの停滞がみられることが確認された。

今後の研究の推進方策

(1) ESCRT障害の異常蛋白蓄積ならびに神経変性過程への影響観察: 新たに作成したESCRT-0/Hrsの前脳特異的コンディショナルノックアウトマウスにおける変性疾患関連蛋白（αシヌクレイン、タウ、TDP-43など）のクリアランス障害、リソソーム・オートファジー機能障害および神経変性機序の解析を進める。今年度はPD病態をより意識して、ドパミン神経特異的にESCRTを欠損させた全く新しいPDモデルマウスを作製し、その表現型解析を行う。
(2) DNAJC13/RME-8遺伝子変異による家族性PD発症機構解明: エンドソーム関連分子であるDNAJC13/RME-8変異による家族性PD発症機構について、タイムラプス装置と共焦点レーザー顕微鏡を駆使した培養細胞実験およびショウジョウバエモデルを用いたin vivoでの病態解析を進め、同遺伝子変異による小胞輸送機構異常部位を明らかにするとともにαシヌクレイン細胞内輸送・分解・分泌への影響を確認する。
(3) 異常凝集タンパク伝播阻止に立脚したシヌクレイノパチーの新規治療法確立: 本学工学部との共同研究でmicrofluidic deviceを用いたin vitroでの神経・グリア間αシヌクレイン伝播モデルを確立し、異常蛋白伝播を抑制する化合物のハイスループット・セルベーススクリーニングを実施する。同実験で得られたヒット化合物については、ヒト組換えモノマー・フィブリル化αシヌクレインを脳内摂取したマウスモデルを用い、これまでの研究で同蛋白の取り込み抑制効果の判明しているセルトラリンなどの薬剤と同時に、治療効果を判定する予定である。

次年度使用額が生じた理由

細胞実験に用いる消耗品購入予定が、当初予定額より少なく済んだため。

次年度使用額の使用計画

次年度への繰り越し金はすべて消耗品（細胞培養関連試薬）の購入に充当する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Lys-63-linked Ubiquitination by E3 Ubiquitin Ligase Nedd4-1 Facilitates Endosomal Sequestration of Internalized α-Synuclein. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sugeno N, Hasegawa T, Tanaka N, Fukuda M, Wakabayashi K, Oshima R, Konno M, Miura E, Kikuchi A, Baba T, Anan T, Nakao M, Geisler S, Aoki M, Takeda A.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 ページ: 18137-18151
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.529461
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] VPS35 dysfunction impairs lysosomal degradation of α-synuclein and exacerbates neurotoxicity in a Drosophila model of Parkinson's disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miura E, Hasegawa T, Konno M, Suzuki M, Sugeno N, Fujikake N, Geisler S, Tabuchi M, Oshima R, Kikuchi A, Baba T, Wada K, Nagai Y, Takeda A, Aoki M.
  • 雑誌名: Neurobiol Dis 巻: 71 ページ: 1-13
  • DOI: 10.1016/j.nbd.2014.07.014
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Neural Substrates of Cognitive Subtypes in Parkinson’s Disease: A 3-Year Longitudinal Study. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shoji Y, Nishio Y, Baba T, Uchiyama m, Yokoi K, Ishioka T, Hosokai Y, Hirayama K, Fukuda H, Aoki M, Hasegawa T, Takeda A, Mori E.
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 9 ページ: e110547
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0110547
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Olfactory Dysfunction and Dementia in Parkinson’s Disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeda A, Baba T, Kikuchi A, Hasegawa T, Sugeno N, Konno M, Miura E, Mori E.
  • 雑誌名: J Parkinson Dis 巻: 4 ページ: 181-187
  • DOI: 10.3233/JPD-130277
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rhinorrhea in Parkinson's disease: A consecutive multicenter study in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kano O, Yoshioka M, Nagayama H, Hamada S, Maeda T, Hasegawa T, Kadowaki T, Sengoku R, Terashi H, Hatano T, Nomoto N, Inoue M, Shimura H, Takahashi T, Uchiyama T, Watanabe H, Kaneko S, Takahashi T, Baba Y, Kubo S, Young Japanese Expert Group for Parkinson's Disease and Movement Disorders: YJ-EXPANDS
  • 雑誌名: J Neurol Sci 巻: 343 ページ: 88-90
  • DOI: 10.1016/j.jns.2014.05.039
  • 査読あり
• [学会発表] How does exogenous alpha-synuclein get access to the endogenous alpha-synuclein proteins? (2015)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: 2015 MDS course Alpha-Synuclein: The Gateway to Parkinsonism
  • 発表場所: Innsbruck, Austria
  • 年月日: 2015-02-11 – 2015-02-13
  • 招待講演
• [学会発表] Functional ESCRT machinery is required for the clearance of aggregate-prone proteins associated with neurodegenerative diseases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: th Asian and Oceanian Parkinson's disease and movement disorders congress
  • 発表場所: Pattaya, Thailand
  • 年月日: 2014-11-28 – 2014-11-30
• [学会発表] Aberrant Vesicular Trafficking In Parkinson’s disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: The 2nd East Asia German Alumni Symposia in Life Science
  • 発表場所: Taipei, Taiwan
  • 年月日: 2014-10-17 – 2014-10-19
  • 招待講演
• [学会発表] Role of ESCRT machinery in the clearance of aggregate-prone proteins associa ted with neurodegenerative diseases. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: 第87回 生化学会大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Retromer dysfunction as an emerging mechanism of Parkinson's disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: 第37回日本神経科学大会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-13
  • 招待講演
• [学会発表] Vesicular trafficking defect in the pathogenesis of Parkinson’s disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: 2014 ICME International Conference on Complex Medical Engineering
  • 発表場所: Taipei, Taiwan
  • 年月日: 2014-07-26 – 2014-07-29
  • 招待講演
• [学会発表] VPS35 dysfunction impairs lysosomal degradation of [alpha]-synuclein and exacerbates neurotoxicity in a drosophila model of Parkinson's disease. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T
  • 学会等名: The MDS 18th International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders
  • 発表場所: Stockholm, Sweden
  • 年月日: 2014-06-08 – 2014-06-12
• [学会発表] Nedd4 regulates internalization and endosomal targeting of alpha-synuclein. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa T, Sugeno N, Tanaka N, Fukuda M, Wakabayashi K, Oshima R, Konno M, Miura E, Kikuchi A, Baba T, Anan T, Nakao M, Geisler S, Takeda A, Aoki M
  • 学会等名: 第55回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 2014-05-21 – 2014-05-24