| 研究課題/領域番号 |
26461273
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
鎌田 崇嗣 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 共同研究員 (70614460)
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| 研究分担者 |
高瀬 敬一郎 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00467903)
山口 浩雄 九州大学, 大学病院, 講師 (00701830)
重藤 寛史 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50335965)
真崎 勝久 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90612903)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | てんかん / 動物モデル / 皮質異形成 / 海馬 |
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| 研究実績の概要 |
自発海馬てんかんを有する皮質異形成モデルラットの作製。片側頭蓋に皮質異形成を作製したもので4%PFAにて組織を潅流固定した後、脳標本を用いて、各段階生後2週目、3週目、4週目、8週目で皮質異形成側と正常皮質側の海馬での発現を免疫組織化学的（特異抗体を用いた酵素抗体法）に、Cx43、AQP4、TLR4、NMDAR2A、NMDAR2B、GADのそれぞれで比較した。その結果としては、上記いずれも有意な差を認めなかった。そのため、現在は両側皮質異形成モデルラットとシャムモデルラットの海馬にて、IL-1R1、TLR4、Cx32、Cx43、Cx47、AQP4（アストロサイトのマーカー）、Iba-1（ミクログリアのマーカー）のより細かい発現量の差を確認するために、生後2、4、6、8、10週目の各段階での脳標本にて、リアルタイムPCRでの解析を継続中である。
また、皮質異形成のマウスの自発てんかん発症前、発症後のCxを脱落させることによって異常な神経ネットワークの形成をシャットダウンさせ、これがてんかん原性の獲得に及ぼす影響を評価するためにCx遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。今回は、Cx43遺伝子を標的として、Cx flfとCx flf：GLAST-CreERのマウスを交配させた（前回はCx flf：GFAP-CreERのコンディショナルノックアウトマウスを作製）。出生後ジェノタイプを確認しCx flf：GLAST-CreERのマウスに対して、タモキシフェンを5日間投与して標的とするアストロサイトのCx43を脱落させた。そのCx43が実際に脱落していることを免疫組織化学的（特異抗体を用いた酵素抗体法）でコントロールと比較して確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫組織化学的解析による自発てんかんを有する皮質異形成モデルラットの海馬のTLR4、各種コネキシン群タンパクの発現変化の解析では、有意な上昇または低下がみられていない。そのため、両側皮質異形成モデルラットの海馬にてTLR4、IL-1R1、各種コネキシン群タンパクの発現変化の定量化による解析をリアルタイムPCR法にて継続している。また、海馬全体として発現を評価するのではなく、CA1、CA2、CA3、歯状回と海馬の部位を細かく区別して評価することとした（てんかん患者の海馬において各種コネキシン群タンパクの発現は部位により差があるという報告がなされている）。また、アストロサイトの突起部位に発現しているAQP4およびミクログリアのマーカーであるIba-1の発現の変化も解析に追加した。海馬のより細かい解析を実施しており、そのために当初の予定より達成度が遅れている状態である。
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| 今後の研究の推進方策 |
（シャムモデルラットの海馬と比較した）自発てんかんを有する皮質異形成モデルラットの海馬のCA1、CA2、CA3、歯状回の各部位におけるTLR4、IL-1R1、各種コネキシン群タンパク（Cx32、43、47）、AQP4、Iba-1の発現のリアルタイムPCR法による解析を継続する。
また、今回作製されたCx43遺伝子を標的としたコンディショナルノックアウトマウスを使用して、胎生期に凍結損傷を頭蓋に与え、自発てんかんを有する皮質異形成マウスモデルを作製。生後2週間目でタモキシフェンを5日間投与して標的とするアストロサイトのCx43を脱落させる。生後4週間目に頭部に脳波測定用の記録電極を設置、生後5週目より脳波測定を開始し、生後11週目まで継続して自発てんかん発症の有無、発症時期、発作の頻度を解析する。また、てんかんを発症する5～6週以後の生後7週目においてタモキシフェンの投与を行い、同様の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
自発てんかんを有する皮質異形成モデルラットの海馬TLR4、IL-1R1、各種コネキシン群タンパク（Cx32、43、47）、AQP4、Iba-1の発現のリアルタイムPCR法による解析を継続するため。
また、コンディショナルノックアウトマウスを使用して、自発てんかんを有する皮質異形成マウスモデルを作製する。生後タモキシフェンの投与でCx43を脱落させることによる自発てんかん発症の有無、発症時期、発作の頻度の変化を解析するため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
自発てんかんを有する皮質異形成モデルラットの海馬のTLR4、IL-1R1、各種コネキシン群タンパク（Cx32、43、47）、AQP4、Iba-1の発現のリアルタイムPCR法による解析を継続するための実験用動物、分子生物学的実験に関わる各種抗体などの必要物品、RNA抽出キット、rtPCR用試薬などの購入のために使用する予定。
また、コンディショナルノックアウトマウスを使用して、自発てんかんを有する皮質異形成マウスモデルを作製する。生後タモキシフェンの投与でCx43を脱落させることによる自発てんかん発症の有無、発症時期、発作の頻度の変化を解析する。そのための脳波測定のための記録用電極などの部品、タモキシフェンなどの試薬、コンディショナルノックアウトマウス作製などに伴う消耗品の購入に使用する予定。
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