| 研究課題/領域番号 |
26461276
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
水野 敏樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30264782)
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| 研究分担者 |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80264753)
水田 依久子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80397760)
大原 亮 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80636986)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | CADASIL / 脳小血管病 / Notch3 / trasnendocytosis |
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| 研究実績の概要 |
【目的】Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Sub- cortical Infarcts and Leukoencephalopathy (CADASIL)はNOTCH3が原因遺伝子である遺伝性脳小血管病だが、その発症機序はまだ十分に解明されていない。Notch signalの活性化には、受容体として働くNotch細胞外ドメインが、リガンドと結合後にリガンド発現細胞内へ取り込まれるtransendocytosisが重要であると提唱されている。我々が提唱している変異型NOTCH3のtransendocytosis障害によるCADASIL発症機序の解明のため、平成26年度は変異蛋白に相同する合成ペプチドによるendocytosisを細胞レベルで検証を行った．
【方法】NOTCH3シグナルのリガンド蛋白であるJagged-1のC末側にstop codonまたはmyc-HisタグをつけたpcDNATM5/ FRT/TOベクターを、Flip- In-T-REX host細胞へ導入し、テトラサイクリンによりリガンド細胞一分子のみの発現を制御する細胞株を樹立、リガンド蛋白の発現を免疫染色、ウェスタンブロット法で検討する．
【成績】NOTCH3シグナルのリガンド蛋白であるJagged-1のC末側にmyc-Hisタグをつけたベクター作製を確認した．現在テトラサイクリン付加時にdeltaの細胞表面での発現を免疫染色とウェスタンブロット法で確認している．
【結論】Jagged-1の細胞表面での発現を確認後、変異蛋白に相同する合成ペプチドによるendocytosisを細胞レベルで検証を行う．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
transendocytosisを可視化するため、数種類のhost cellへリガンド蛋白一分子を発現するFlip-In systemの導入を試みたが、従来用いられているHEK293株以外の細胞株では導入が困難であり、HEK293株を用いて実験系を再構築するのに時間を要した．
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| 今後の研究の推進方策 |
目的のリガンド蛋白の導入を確認後、種々のNotch３細胞外ドメイン断片を用いて、endocytosisを細胞レベルで検証する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験に用いるNotch3リガンド発現細胞の樹立に時間を要し、解析が遅れたため
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| 次年度使用額の使用計画 |
Notch3リガンド発現細胞の樹立ができたので、今後このリガンド細胞へのNotch3細胞外断片の取り込みを経時的に免疫蛍光染色、ウェスタンブロットで解析する
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