transendocytosis障害による脳小血管病発症機序の解明と治療法開発

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461276
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 水野 敏樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30264782)
• 研究分担者: 田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80264753) ; 水田 依久子 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80397760) ; 大原 亮 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80636986) [辞退]
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 脳小血管病 / CADASIL

研究実績の概要

【目的】Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Sub- cortical Infarcts and Leukoencephalopathy (CADASIL)はNOTCH3が原因遺伝子である遺伝性脳小血管病だが、その発症機序はまだ十分に解明されていない。Notch signalの活性化には、受容体として働くNotch細胞外ドメインが、リガンドと結合後にリガンド発現細胞内へ取り込まれるtransendocytosisが重要であると提唱されている。申請者らが提唱している変異型NOTCH3のtransendocytosis障害によるCADASIL発症機序の解明のため、平成27年度は昨年度に引き続き合成ペプチドによるendocytosisを細胞レベルで検証した。
【方法】Notchシグナルのリガンド蛋白であるJagged-1にmyc-Hisタグを付けたpcDNATM5/FRT/T0ベクター用いて、リガンドを発現する細胞株を樹立した。CADASIL型変異を有するヒトNOTCH3細胞外ドメインを加えて、transendocytosisの有無を免疫染色、western blottingで確認した。
【結果】野生型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片が細胞内に取り込まれ、lysozomeに局在することを免疫染色で確認した。
【考察】野生型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片はtransendocytosisでリガンド細胞内取り込まれ、lysozomeで分解されることが示唆された。同様の現象が変異型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片では障害されているかを今後検討する。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

野生型ヒトNOTCH3断片は作成可能であったが、変異型NOTCH3細胞断片の作成を試みたところ、細胞内で凝集してしまい、抽出が難しい。作成する断片の大きさを変えながらペプチド合成を現在試みている。

今後の研究の推進方策

種々の変異型NOTCH3細胞断片を作成してendocytosisの有無を検討するとともに、変異型リガンドを作成することで、endocytosisが障害を受けるかを今後検討する。

次年度使用額が生じた理由

前年度実験計画が順調に進まず滞ったため、消耗品の使用が予定より少なかった

次年度使用額の使用計画

本年度実験用の消耗品を主に用いる予定である

研究成果

• [雑誌論文] Distinct molecular mechanisms of HTRA1 mutants in manifesting heterozygotes with CARASIL. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nozaki H, Kato T, Nihonmatsu M, Saito Y, Mizuta I, Noda T, Koike R, Miyazaki K, Kaito M, Ito S, Makino M, Koyama A, Shiga A, Uemura M, Sekine Y, Murakami A, Moritani S, Hara K, Yokoseki A, Kuwano R, Endo N, Momotsu T, Yoshida M, Nishizawa M, Mizuno T, Onodera O
  • 雑誌名: Neurology 巻: 86 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000002694.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Very prolonged capsular warning syndrome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Makita N, Yamamoto Y, Nagakane Y, Ashida S, Mizuno T.
  • 雑誌名: J Neurol Sci. 2015 巻: 352 ページ: 115-116
  • DOI: 10.1016/j.jns.2015.03.023.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 皮質下性認知症の現代的捉え方 遺伝性脳小血管病からの解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 水野敏樹
  • 雑誌名: BRAIN and NERVE 巻: 67 ページ: 403-412
• [雑誌論文] 脳卒中臨床の最新の話題 遺伝性脳小血管病（CADASIL,CALASIL) (2015)
  • 著者名/発表者名: 向井麻央,水野敏樹
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 254 ページ: 113-117
• [学会発表] 認知症を伴うCADASIL症例のスクリーニング認知機能検査にみられる特徴 (2015)
  • 著者名/発表者名: 手塚 陽子, 近藤 正樹,水野 敏樹
  • 学会等名: 第6回日本脳血管・認知症学会学術大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2015-09-19
• [学会発表] Consideration of Issues Related to Pre-and Post-Genetic Test for CADASIL (2015)
  • 著者名/発表者名: Ikuko Mizuta, Mao Mukai, Akiko Watanabe, Ai Hamano, Tomoyuki Ohara, Tomokatsu Yoshida, Toshiki Mizuno
  • 学会等名: The 7th Vas-Cog World Conference
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2015-09-16 – 2015-09-19
  • 国際学会
• [学会発表] Validation of Japanese Diagnostic Criteria for Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcorical Infarcts and Leukocencephalopathy (2015)
  • 著者名/発表者名: Toshiki Mizuno, Ikuko Mizuta, Akiko Watanabe, Ai Hamano, Mao Mukai, Masaki Kondo, Masanori Nakagawa, Hidekazu Tomimoto, Makoto Uchino, Osamu Onodera.
  • 学会等名: The 7th Vas-Cog World Conference
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2015-09-16 – 2015-09-19
  • 国際学会
• [学会発表] A Case Report of CADASIL with a Homozygous NOTCH3 Mutation Arg544Cys (2015)
  • 著者名/発表者名: Mao Mukai, Daisuke N,Yukie Kushimura,Yu-ichi Noto, Tomoyuki Ohara, Ikuko Mizuta, Toshiki Mizuno.
  • 学会等名: The 7th Vas-Cog World Conference
  • 発表場所: Tokyo
  • 年月日: 2015-09-16 – 2015-09-19
  • 国際学会