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2014 年度 実施状況報告書

α-ジストログリカノパチーによる筋ジストロフィーに対する糖転移酵素補充療法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 26461281
研究機関帝京大学

研究代表者

斉藤 史明  帝京大学, 医学部, 准教授 (40286993)

研究分担者 真先 敏弘  帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (00585028)
萩原 宏毅  帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (80276732)
研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード筋ジストロフィー / α-ジストログリカノパチー / α-ジストログリカン / フクチン / 酵素補充療法
研究実績の概要

α-ジストログリカン(α-DG)はジストロフィン糖蛋白複合体の構成蛋白質であり、糖鎖を介して細胞外のラミニンと結合することで細胞膜を安定化している。近年α-DGの糖鎖修飾の異常により筋ジストロフィー、脳奇形、心筋症など多彩な疾患が発症することが明らかとなりこれらはα-ジストログリカノパチーと総称されている。本疾患群では糖転移酵素をコードする遺伝子の変異によりα-DGの糖鎖修飾が未熟な状態にとどまり、この結果α-DGとラミニンとの結合が断たれることが原因と考えられている。本研究はα-ジストログリカノパチーの原因となっている糖転移酵素を体外から投与することによりα-DGとラミニンとの結合性を回復させて疾患の治療を目指す、すなわち糖転移酵素補充療法の実現に向けての基礎的な研究を行うことを目的としている。本年度は福山型先天性筋ジストロフィーで欠損しているfukutinと、小胞体への運搬体として利用するコレラトキシンBサブユニットあるいはリシンBサブユニットとの融合蛋白のコンストラクトを作製した。そしれこれらを細胞に遺伝子同導入してα-DGの糖鎖修飾が正常化するかどうかをfukutin欠損マウスES細胞を用いて検討した。しかしリポフェクション法、エレクトロポレーション法などを試みたものの遺伝子導入効率が低く、十分な量の蛋白質の発現が得られなかった。そこで細胞の系を遺伝子導入効率の高いHEK293に変更して、現在これにCRISPR/Cas9を用いてfukutinノックアウト細胞株の作製に取りかかっている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

上述のようにfukutin欠損マウスES細胞へfukutin融合蛋白質の遺伝子導入を行い、コンストラクトが有効に機能するかどうかを検討する予定であった。しかしES細胞の遺伝子導入効率が予想外に低かったため、代替の方法としてHEK293細胞にCRISPR/Cas9を用いてfukutinノックアウト細胞を作製しているところである。本来ならば今年度中にこれらコンストラクトのチェックに加えてfukutin融合蛋白質のスモールスケールでの作製までを目指していたことから、現在までの達成度としては遅れていると判断した。

今後の研究の推進方策

以下のように培養細胞を用いたin vivoの系における酵素補充療法の検討から、さらに疾患モデルマウスを用いた検討へと順次実験を進めていく。
1)培養細胞に対する糖転移酵素の補充によるα-DGの機能回復
まずはCRISPR/Cas9を用いてfukutinノックアウトHEK293細胞株を作製する。そして今回作製した各種fukutinコンストラクトをこれら細胞に遺伝子導入し、α-DGの糖鎖修飾が正常化するか否かを検討する。α-DGの糖鎖が正常化してラミニン結合能が回復したらそれらのコンストラクトを用いてHEK293細胞へ再度遺伝子導入を行い、fukutin融合蛋白質のスモールスケールでの精製を行う。得られた融合蛋白質をfukutinノックアウトHEK293細胞の培養細胞上清に添加し、これら蛋白質が細胞内へ取り込まれて小胞体からゴルジ体へ局在するかどうか、α-DGの糖鎖修飾やラミニン結合能が回復するかどうかを検討する。
2)筋ジストロフィーモデルマウスに対する糖転移酵素補充療法の試み
マウスへの投与実験に備えてfukutin融合蛋白質をラージスケールで精製する。そして同蛋白質を福山型先天性筋ジストロフィーのモデルマウスであるfukutin conditional knockoutマウスに体外から投与し、筋ジストロフィーに対する改善効果を検討する。このためにマウス骨格筋におけるα-DGの糖鎖修飾の正常化とラミニン結合能の回復の有無、程度を指標として投与量、投与期間、投与経路などを選択する。そしてマウスの外観、運動機能、血中CK値、骨格筋の病理組織像、などを指標に筋ジストロフィーモデルマウスに対する治療効果の有無を総合的に判定する。

次年度使用額が生じた理由

購入を予定していた実験用試薬は残額よりも高額だったため。

次年度使用額の使用計画

次年度助成金と合わせて実験用試薬を購入し、実験を進める。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2014

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] Overexpression of LARGE suppresses muscle regeneration via down-regulation of insulin-like growth factor 1 and aggravates muscular dystrophy in mice.2014

    • 著者名/発表者名
      Saito F, Kanagawa M, Ikeda M, Hagiwara H, Masaki T, Ohkuma H, Katanosaka Y, Shimizu T, Sonoo M, Toda T, Matsumura K.
    • 雑誌名

      Hum Mol Genet

      巻: 23 ページ: 4543-4558

    • DOI

      10.1093/hmg/ddu168

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] LARGEの過剰発現はIGF-1の発現低下により筋再生を抑制してマウスの筋ジストロフィーを悪化させる2014

    • 著者名/発表者名
      斉藤史明、金川基、池田美樹、萩原宏毅、真先敏弘、大熊秀彦、片野坂友紀、清水輝夫、園生雅弘、戸田達史、松村 喜一郎
    • 学会等名
      第87回日本生化学会大会
    • 発表場所
      京都
    • 年月日
      2014-10-18
  • [学会発表] LARGEの過剰発現による筋ジストロフィーモデルマウスにおける筋再生の抑制2014

    • 著者名/発表者名
      斉藤史明、金川基、池田美樹、萩原宏毅、真先敏弘、大熊秀彦、片野坂友紀、清水輝夫、園生雅弘、戸田達史、松村 喜一郎
    • 学会等名
      第37回日本神経科学大会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] FukutinノックアウトマウスにおけるLARGEの過剰発現 - 治療応用へ向けての課題 -2014

    • 著者名/発表者名
      斉藤史明、金川基、萩原宏毅、真先敏弘、池田美樹、清水輝夫、園生雅弘、戸田達史、松村 喜一郎
    • 学会等名
      第55回日本神経学会学術大会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2014-05-24
  • [学会発表] レスベラトロールは線維化を軽減し先天性筋ジストロフィーモデルの症状を改善する2014

    • 著者名/発表者名
      萩原宏毅、斉藤史明、真先敏弘、松村喜一郎、園生雅弘
    • 学会等名
      第55回日本神経学会学術大会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2014-05-24

URL: 

公開日: 2016-05-27  

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