| 研究課題/領域番号 |
26461342
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
木村 俊秀 大分大学, 医学部, 准教授 (60404373)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 糖尿病 / インスリン / 膵B細胞 / シグナル伝達 / プロテオーム / タンパク質 / 低分子量Gタンパク質 / Rab27a |
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| 研究実績の概要 |
申請者は、これまで不活性型と考えられてきたGDP型Rab27aに結合する分子としてcoronin3とIQGAP1を同定し、その結合が膵B細胞でエンドサイトーシスを制御することを示した。申請者は最近、GDP型Rab27a結合候補タンパク質としてプロトンポンプの構成分子のひとつであるvATPaseを同定した。本研究は、vATPaseの膵B細胞における機能を分子レベルで明らかにすることを目的としている。平成26年度は、GDP型Rab27aとvATPaseの結合様式を生化学的手法で調べた。本年度は、その結合がプロトンポンプ活性に及ぼす影響を調べた。
まず、前年度に明らかにしたGDP型Rab27a 結合ドメインから、結合に必要なアミノ酸を同定した。上記アミノ酸は、vATPaseの構造を調節し、プロトンポンプ活性を制御する領域に相当した。そこで、GDP型Rab27aがvATPaseの構造に及ぼす影響を検討した結果、GDP型Rab27aがvATPaseの活性を調節することを明らかにした。
以上の結果より、GDP型Rab27aがvATPaseのプロトンポンプ活性を調節することが明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うvATPaseによるエンドサイトーシスの制御機構を理解する上で極めて重要であると共に、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では、GDP型Rab27aとその結合タンパク質であるvATPaseが、インスリン顆粒膜のエンドサイトーシスを制御する分子メカニズムを、以下に従って解明する予定である。
平成26年度：GDP型Rab27aとvATPaseの結合を評価する。
平成27年度：その結合がプロトンポンプ活性に及ぼす影響を解析する。
平成28年度：GDP型Rab27aと結合したvATPaseがエンドサイトーシスで果たす役割を検討する。
本年度は、GDP型Rab27aとの結合がvATPaseのプロトンポンプ活性に及ぼす影響を明らかにした。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、前年度の成果を基盤にvATPaseがエンドサイトーシスで果たす役割を検討する。
1) グルコース刺激は、Rab27aを細胞質から細胞膜に移行させることで、エキソサイトーシスからエンドサイトーシスへシグナルを切り替える。そこで、MIN6細胞をグルコースで刺激し、vATPase複合体の形成と解離を共焦点レーザー顕微鏡で解析する。
2) siRNAや各変異体、中和抗体をMIN6細胞に導入し、エンドサイトーシスに及ぼす影響を抗体の取り込み実験やエンドサイトーシスマーカーFM4-64により解析する。
3) 上記細胞におけるリソソームの形態変化を、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡を用いて解析する。
4) 取り込まれた顆粒内の酸性化や、引き続いておこるリソソームとの融合を生化学的に解析する。具体的には、遠心法やゲル濾過クロマトグラフィー、ショ糖密度勾配遠心法を用いて顆粒膜やリソソームの分画を精製し、各マーカーを用いたイムノブロットを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
pHの測定は、当初想定していた市販のpH蛍光プローブではなく、申請者が作製した抗体の取り込み実験により行った。そのため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当該研究費は、翌年度以降の研究費と共に、本抗体を追加で精製する費用にあてる予定である。平成28年度は、前年度の成果を基盤にvATPaseがエンドサイトーシスで果たす役割を検討する。
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