| 研究課題/領域番号 |
26461378
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
松下 明生 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (50402269)
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| 研究分担者 |
佐々木 茂和 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (20303547)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 甲状腺ホルモン / 転写調節 / 核内受容体 / 転写伸長因子 |
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| 研究実績の概要 |
甲状腺ホルモン(T3)受容体(TR)の作用メカニズムに関わる転写因子の検索を行い、RNA polymerase II (RNAPII)のmRNA合成反応を進行させる転写伸長因子P-TEFbの構成要素であるcyclin dependent kinase (CDK) 9がTRと結合することを発見した。さらに、CDK9阻害剤の添加やCDK9のノックダウンによりT3/TR標的遺伝子の転写活性化が障害されたことから、T3/TRによる遺伝子転写調節にP-TEFbとの相互作用を介した転写活性化機構が存在することが考えられた。
TRはT3存在下でRNAPIIを標的遺伝子上へ呼び込んで転写を開始するだけでなく、CDK9との相互作用を介してRNAPIIのC-terminal repeat domain (CTD)の Ser2を速やかにリン酸化し、転写伸長反応を進めることでmRNA合成を活性化していることが予想された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TRとCDK9の相互作用に関して、両者の蛋白-蛋白結合をCo-IPとGST-pull down法で証明することができた。CDK9の働きを抑制することでT3/TRの転写活性化が減弱することも確認され、機能的にも両者が関連しあっていることが示された。研究の達成度としては70％程度と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
T3/TR標的遺伝子のプロモーター上にTRとCDK9が共存していることを証明するため、標的遺伝子のT3応答配列(TRE)領域にプライマーを設計し、クロマチン免疫沈降法(ChIP assay)で確認する予定である。現在、CDK9とTRの特異的抗体を数種類用いて最適な反応条件を検討している。
さらにT3添加により標的遺伝子上のRNAPIIのCTDリン酸化の状態が変化するかどうかをCTDリン酸化RNAP II特異的な抗体を用いたChIP assayで確認する予定である。
これまで行ったTRとCDK9との結合部位の検討では、TRのリガンド結合領域のC末端が両者の結合に重要であることが判明した。この領域は甲状腺ホルモン不応症患者で過去に報告されている変異部位と一致している。これまで不応症患者で報告されているTRβ遺伝子変異の中には、CDK9との結合が減弱し、転写活性化能を喪失した変異体が混在しているのかもしれない。
また、TR遺伝子変異を認めない甲状腺ホルモン不応症(non-TR RTH)の症例の中に、TRとの結合が減弱したCDK9変異の症例が含まれている可能性がある。他の転写因子との結合を損なうことなくTR特異的に結合が障害されるような変異が存在するのか、さらに詳細な結合様式の検討が必要と考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の支出は主に実験に用いる試薬、抗体、細胞培養用の培地やプラスチック製品などの物品費にあてている。ほぼ初年度の計画通りの支出額であり、わずかに端数の金額が次年度への繰り越しとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の消耗品等の物品費に充てる予定である
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