構成的アルドステロン産生に着目した副腎皮質リモデリングの分子機構

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461387
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 向井 邦晃 慶應義塾大学, 医学部, 専任講師 (80229913)
• 研究分担者: 樋口 明弘 慶應義塾大学, 医学部, 講師(非常勤) (20383755) ; 荻島 正 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70177153)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: アルドステロン / ステロイドホルモン / 副腎

研究実績の概要

本課題の全体構想は、副腎皮質のアルドステロン(ALDO)産生機能と組織構築の統御、そこからの逸脱に関わる分子機構の解析により、正常組織の形成・維持から病態に至る分子基盤を理解することである。近年、正常副腎皮質の細胞層形成は、被膜細胞から前駆細胞へ、さらに選択的ホルモン産生能を持った実質細胞への分化と内奥部への移動によることが示された。これに対し研究代表者らは、このスキームでは説明できない組織様式を正常副腎に発見した。すなわち正常及び非腫瘍部副腎の被膜下に自律的にALDOを産生する細胞集塊(ALDO産生細胞クラスター, APCC）が生じることを示した。一方、ALDO産生腺腫(APA)にイオンチャネル・ポンプ遺伝子4種の体細胞変異が報告され、ALDO産生の自律性に関与することが示された。
APCCはAPA同様に自律的にALDOを産生することが推定されることから、研究代表者はAPCCにもAPAに検出された体細胞変異が存在することを疑った。明らかな腺腫を認めないが原発性ALDO症により摘出された副腎２例に対してALDO合成酵素CYP11B2の免疫組織化学を行ったところ、APCC部とマイクロAPA部から構成される融合病変(進展型APCC)が検出された。これらの進展型APCCにおける体細胞変異の解析を行った。
進展型APCCと非病変部の薄切試料からゲノムDNAを調製し、イオンチャネル・ポンプ遺伝子４種についてAPAに検出された既知の体細胞変異近傍を次世代シーケンサーにより解析した。その結果、進展型APCCにおいてもAPAに検出されたKCNJ5 (p.G151R)などの既知の体細胞変異が検出された。同一副腎の中の異なる病変には異なる体細胞変異が生じうること、APAでは報告のない新規の体細胞変異を持つ病変が存在すること、既知の変異を持たない進展型APCCが存在することが判明した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

代表者は、APCC及び進展型APCCに疑われる体細胞変異の解析にはゲノム全体を対象とすべきであると考えていた。しかし、病変が微小であることから、病変部位から必要量のDNAを調製することが困難であった。最近APAに起きた体細胞変異解析の報告が蓄積しつつあり、その結果によるとイオンチャネル・ポンプをコードする4遺伝子に特定の塩基置換が集中的に起きていることが判明した。代表者はこの結果に着目して、解析対象をそれらの変異部位を含む領域に限定した。その結果、微量のDNAから当該領域の塩基配列を解析することができた。得られた塩基配列データによると、APAについて報告された既知の体細胞変異が検出された。また、新規の体細胞変異が検出された。一部の病変には解析した配列に変異は検出されなかった。
以上から、(1)解析対象のゲノム部位を限定することにより微小な組織からの体細胞変異解析が可能であることが判明した。(2)APAにおける既知の体細胞変異が進展型APCC病変にも起きていることが判明した。この結果は進展型APCCからAPAへ移行する可能性を示唆している。(3)進展型APCCには新規の体細胞変異が同定された。この結果からはAPAとは異なる体細胞変異も進展型APCCの形成に関わる可能性が示唆された。これら3点により、本課題はおおむね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

研究代表者は研究結果を踏まえ、APAの形成について次の仮説を持っている。(1)正常副腎皮質の被膜下に第１の体細胞変異が生じ、これが原因の少なくとも一部となってAPCCが被膜下に形成される。(2)APCCはアンギオテンシンIIなどによる誘導を受けずにALDOを自律的に産生する。(3)APCCを構成する細胞に第2の体細胞変異が生じ増殖が活性化してマイクロAPA部を形成する。(4)マイクロAPA部には、ALDO産生能を持つ細胞、ALDO産生能を失いコルチゾール産生能を獲得した細胞、ALDOとコルチゾール両方の産生能を持たない細胞の少なくとも3種類が生じる。
これまでの研究経過により、微小組織から調製したゲノムDNAを用いて特定の遺伝子の限定した領域を対象に次世代シーケンサーを用いて塩基配列を解析できることが判明した。これを受けて上記仮説の検証を行うため、次年度には計画を一部変更する。進展型APCCは被膜下のAPCC部と内奥部のマイクロAPA部から構成される。これらの部位別にゲノムDNAを調製し、4遺伝子の特定領域の塩基配列を解析する。例数と部位数を増加させることが必要と考えている。さらにAPAは構成する細胞のステロイド産生機能が均一ではないことから、APA内のCYP11B2とCYP11B1の発現分布にもとづいた機能別微小部位からゲノムDNAを調製して同一ゲノム領域を対象として塩基配列解析を行う。
上記計画に加えて当初の計画通り、APCCにおけるCYP11B2遺伝子の選択的かつ構成的発現機構に関して、APCC部と非APCC部からクロマチンを調製し、CYP11B2遺伝子の転写開始点近傍DNAの塩基修飾を解析することにより、遺伝子の塩基配列以外の構造に関するAPCC部と非APCC部の間の差異を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額が生じた理由は次の2点による。
(1)試薬等の支出額が計上額を下回ったこと。研究当初、微小な組織の体細胞変異の検出には試行錯誤を繰り返す必要性を考えていた。しかし、試料の調製、増幅、塩基配列解析などの過程が予想ほど困難を伴わずに解析を行うことができた。この結果、物品費（消耗品等）の使用額が減少した。
(2)旅費、その他（運搬費等）の支出額が計上額を下回ったこと。計上していた研究打合せや試料の運搬のための費用を支出しなかったため使用額が減少した。

次年度使用額の使用計画

次年度には、解析対象とする例数、試料数を増加させる必要があるので、生じた次年度使用額を解析に必要な試薬等の物品費（消耗品等）に計上する。品名としては、組織染色試薬、遺伝子配列解析関連試薬等である。

研究成果

• [雑誌論文] Primary aldosteronism: functional histopathology and long-term follow-up after unilateral adrenalectomy (2015)
  • 著者名/発表者名: Volpe, C., Hamberger, B., Hoog, A., Mukai, K., Calissendorff, J., Wahrenberg, H., Zedenius, J., Thoren M.
  • 雑誌名: Clin. Endocrinol. (Oxf) 巻: 82 ページ: 639-647
  • DOI: 10.1111/cen.12645
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Multiple sampling from the central veins with their tributaries can detect bilateral hyperaldosteronism with a cortisol-producing adenoma in a hypertensive patient (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakuma, I., Saito, J., Matsuzawa, Y., Omura, M., Matsui, S., Nishimoto, K., Mukai, K., Nishikawa, T.
  • 雑誌名: J. Steroids Horm. Sci. 巻: 5(2) ページ: -
  • DOI: 10.4172/2157-7536.1000135
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Adrenal nodularity and somatic mutations in primary aldosteronism: one node is the culprit? (2014)
  • 著者名/発表者名: Dekkers, T., ter Meer, M., Lenders, J.W.M., Hermus, A.R.M., L. Schultze Kool, L., Langenhuijsen, J. F., Nishimoto, K., Ogishima, T., Mukai, K., Azizan, E.A.B., Tops, B., Deinum, J., Kusters, B
  • 雑誌名: J. Clin. Endocrinol. Metab. 巻: 99 ページ: E1431-E1451
  • DOI: 10.1210/jc.2013-4255
  • 査読あり
• [雑誌論文] 原発性アルドステロン症におけるCYP11B2免疫染色の意義 (2014)
  • 著者名/発表者名: 西本紘嗣郎、向井邦晃
  • 雑誌名: ホルモンと臨床 巻: 61 ページ: 219-224
• [学会発表] β細胞ストレスに応答する膵島ノンシステミックステロイド合成 (2015)
  • 著者名/発表者名: 荻島正、堤かおり、中村祐貴、前田尚之、向井邦晃、樋口明弘
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府・京都市）
  • 年月日: 2015-10-15 – 2015-10-18
• [学会発表] 涙腺における局所ステロイドの生理機能 (2015)
  • 著者名/発表者名: 樋口明弘、山崎岳、向井邦晃、荻島正、前田尚之、横田博、坪田一男
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都府・京都市）
  • 年月日: 2015-10-15 – 2015-10-18
• [学会発表] アルドステロン合成酵素免疫染色と次世代シーケンサーによるアルドステロン産生腺腫の発生母地の解明 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西本紘嗣郎、小坂威雄、大家基嗣、向井邦晃
  • 学会等名: 第27回内分泌外科学会総会
  • 発表場所: コラッセふくしま（福島県・福島市）
  • 年月日: 2015-05-28 – 2015-05-29
• [学会発表] ヒトにおける11-ケトテストステロンの合成と役割 (2015)
  • 著者名/発表者名: 今道力敬、矢澤隆志、河邉真也、石兼真、向井邦晃、折坂誠、水谷哲也、宮本薫
  • 学会等名: 第88回日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: ホテルニューオータニ東京（東京都・千代田区）
  • 年月日: 2015-04-23 – 2015-04-25
• [学会発表] 原発性アルドステロン症及びサブクリニカルクッシング症候群を呈する副腎皮質癌の１例 (2015)
  • 著者名/発表者名: 河野結衣、内田豊義、清水史孝、朝比奈未紀、西本紘嗣郎、向井邦晃、八尾隆史、堀江重郎、綿田裕孝
  • 学会等名: 第88回日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: ホテルニューオータニ東京（東京都・千代田区）
  • 年月日: 2015-04-23 – 2015-04-25
• [学会発表] Immunohistochemical analysis of cortisol and aldosterone secreting adrenocortical carcinoma (2015)
  • 著者名/発表者名: Murakami, M., Yoshimoto, T., Komatsu, N., Nakano, Y., Minami, I., Mihara, M., Izumiyama, H., Hashimoto, K., Ban, D., Ochiai, T., Takemoto, A., Yukimori, A, Nakajima, H., Akashi, T., Homma, K., Nishimoto, K., Mukai, K., Hasegawa, T., Tanabe, M., Ogawa, Y.
  • 学会等名: The 97th Annual Meeting of The Endocrine Society
  • 発表場所: 米国・サンディエゴ市
  • 年月日: 2015-03-05 – 2015-03-08
• [学会発表] 11-ケトテストステロンはエストロゲン変換を受けないアンドロゲンとして機能する (2015)
  • 著者名/発表者名: 今道力敬、矢澤隆志、河邉真也、石兼真、向井邦晃、折坂誠、水谷哲也、宮本薫
  • 学会等名: 第19回生殖内分泌学会
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター（大阪府・豊中市）
  • 年月日: 2015-01-10 – 2015-01-10