研究課題
申請者らは、マウスにおける新規造血幹細胞マーカーとして血管内皮関連抗原であるendothelial cell-selective adhesion molecule (ESAM)を発見した。そこで、本研究ではESAMをマーカーとして用いてヒト造血幹細胞の純化効率を向上させることを目的として解析を行った。現在臨床で使用されている3つの造血幹細胞ソース（ヒト骨髄、G-CSFによる造血幹細胞動員後の末梢血、臍帯血）から単核球を分離し、フローサイトメトリーを用いて細胞表面のESAM発現を解析した。この結果、ヒト造血幹細胞が含まれるCD34+CD38-分画の多くはESAMを発現していた。ESAM発現強度と造血幹細胞機能との関連を明らかにするため、メチルセルロースアッセイ、MS-5との共培養実験を行った。この結果、より未分化な造血幹細胞はCD34+CD38-ESAMHigh分画に濃縮されていることが分かった。また免疫不全マウスへの移植実験でも、CD34+CD38-ESAMHigh分画はヒト造血を再構築し、ESAMは現在臨床で使われている全ての造血幹細胞ソースにおいてヒト造血幹細胞マーカーとして有用であることが明らかとなった。臍帯血CD34+CD38-分画では、骨髄、G-CSF動員末梢血では認められなかったESAMを非常に高発現する細胞集団(ESAMBright)を認めたため、これがどのような系統の細胞であるのかを解析した。フローサイトメトリーを用いた表面マーカー解析では、ESAMBright細胞は血管内皮系のマーカーを発現していた。セルソーターでESAMHigh細胞とESAMBright細胞とを分取し、マイクロアレイにより遺伝子発現を網羅的に解析した結果、ESAMBright細胞では血管内皮系に関係する遺伝子群の発現が上昇していた。また、ESAMBright細胞はin vitroの培養実験においても血球細胞は産生しない一方、血管内皮のマーカーであるCD31陽性細胞を産生することも分かった。以上より、臍帯血中に認められるCD34+CD38-ESAMBright細胞は血管内皮系に関連した細胞であることが分かった。
2: おおむね順調に進展している
交付申請書では、新規表面マーカーを用いてヒト造血幹細胞の純化効率を上昇させ、高精度のヒト造血幹細胞数評価法を確立することを本研究の第一の目的とした。また、平成26年度の研究計画として、(1)ヒト造血幹細胞におけるESAM発現パターンの解析、(2)CD34+CD38-分画細胞のESAM発現の機能的意義の解析、(3)ESAM発現を指標とした臍帯血造血幹細胞純化効率の向上、の3つを掲げた。初年度の研究により、ヒト造血幹細胞におけるESAM発現パターンとその意義について、多くの研究結果が得られた。すべてのヒト検体は、関連法規を遵守し、施設内審査委員会の承認のもと、インフォームドコンセントの得られたものを用いた。ESAMは、現在臨床的に使用されている3種類の幹細胞ソース（骨髄、G-CSFにより動員された末梢血、臍帯血）の全てにおいてヒト造血幹細胞マーカーとして有用であり、ヒト造血幹細胞はCD34+CD38-ESAMHigh分画に濃縮されていることを明らかにした。一方で、臍帯血中には他の幹細胞ソースには認められないCD34+CD38-ESAMBright細胞を認めた。複数の臍帯血サンプルを解析した結果、CD34+CD38-分画中のESAMHigh細胞とESAMBright細胞の比率はサンプルによって大きくばらつきがあった。これらのESAMBright細胞は造血幹細胞ではなく、血管内皮系に関連する細胞集団であることが分かった。以上の結果より、CD34+CD38-分画のESAM発現強度を指標として造血幹細胞と他の系統の細胞とを分離することができ、臍帯血中の造血幹細胞の純化効率向上につながると考えられた。ここまでの研究成果は日本血液学会学術集会で報告することができた。以上の成果から判断すると、本研究は順調に進展していると考えられる。
初年度の研究は順調に進展しており、今後も当初の計画に基づいて研究を推進する。これまでは、正常細胞におけるESAM発現パターンとその意義について明らかにしており、今後は白血病細胞におけるESAM発現とその意義について解析を進めていく。予備的実験では、骨髄系の白血病細胞株の一部で細胞表面にESAM発現を認めるとの知見を得ている。また、実際の急性骨髄性白血病症例の白血病細胞でも、ESAM発現を認めるものがあった。今後は症例の数を増やして、白血病症例の細胞におけるESAM発現を評価する。白血病の病型によってESAM発現が異なっているのかどうかも解析し、ESAM発現が白血病の病型診断の補助にならないかどうかも検討する。また、同病型の白血病においてESAM発現強度に違いがみられた場合、ESAM発現強度の違いが臨床的な特徴と関連しているのかどうかも調べる。同一患者で経時的なサンプルが得られた場合は、初発時と再発時でESAM発現パターンを比較し、病期によるESAMA発現パターンの変化についても検討を行う。さらに、ヒト白血病細胞におけるESAM発現強度の違いと、白血病細胞の機能との関連性を評価する。具体的には、ESAM発現強度と細胞周期や抗癌剤感受性との関係、培養によりESAM発現に変化がみられるのかを評価する。また、ESAM低発現とESAM高発現の白血病細胞をそれぞれ免疫不全マウスへ移植し、白血病を再現する能力の違いや悪性度の違いを評価する。これらの実験結果をもとに、ESAM発現が白血病細胞の中から白血病幹細胞を同定する指標となりうるかどうかも併せて検討する。
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