| 研究課題/領域番号 |
26461490
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
竹内 康雄 北里大学, 医学部, 准教授 (60286359)
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| 研究分担者 |
竹内 恵美子 北里大学, 医学部, 講師 (00406935)
大津 真 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30361330)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 好中球Netosis / NADPH酵素複合体 / 自己抗原提示 / 活性酸素 |
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| 研究実績の概要 |
１．In vitro 及び In vivo における好中球Netosis の検出
本研究においては好中球Netosisを正確に観察できるシステムを確立することが不可欠である。マウス末梢血より磁気ビーズを用いて好中球を抽出し、一般的条件で、24時間培養した。その後、PMA添加にてNetosis を誘導し以下の２点で確認した。１）in vitro でのNetosis 検出①培養液上清注のDNAの検出（Cytox Green による染色）②培養好中球の形態変化好中球Netosis は確認できたが陽性コントロールとするには不十分と思われる。
２）gp91phox遺伝子欠損マウスでは正常マウスと異なり、真菌菌体成分皮下投与後に肉芽種様病変が見られる。同部には好中球が集簇していることをすでに報告しているが、これらの好中球では異常な Netosisが見られる。そこで、培養好中球ではなく、In vivoにて直接Netosis を観察することを試みた。
２．p40phox siRNAのデザイン：NADPH 酵素複合体を構成するコンポーネントの一つである p40phox は酵素複合体における電子伝達と活性酸素産生には重要な役割は担っていないとされ、p40phoxの制御が酵素複合体活性を適度に抑制し、活性酸素産生とNetosis 制御に結びつくものと想定した。当初の計画に従いp40phox siRNAをデザインし発注する段階である。
３．ヒトSLE モデルマウス (BXSB マウス) における好中球Netosisの検出：１．の結果を用いてBXSBマウス好中球のNetosis 現象を観察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．In vitro 及び In vivo における好中球Netosis の検出；採取したマウス好中球の培養条件、添加するPMA濃度、添加する血清希釈率などでNetosis 誘導効率が大きく異なることが示唆された
２．NADPH酵素複合体構成蛋白に対する siRNAのデザインの検討：最近の研究でp40phox遺伝子欠損でも活性酸素産生障害から免疫不全症を発症することが報告された。従ってp40phox siRNAではNetosis 制御も可能かもしれないが、免疫不全を同時に発症する可能性が生じてきた。
３．免疫不全状態確認の実験方法の検討：p40phox siRNA治療後の免疫不全状態を確認するために滅菌処理したアスペルギルス菌体成分を皮下ないし経気道的に投与し慢性肉芽腫の変化を観察する実験を計画した。しかし、アスペルギルス菌体成分の供給が困難になったため代替実験が必要になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）Netosis陽性コントロール確立のために、好中球培養条件、添加するPMA濃度、添加する血清希釈率などについて検討する。また、観察に適切なCulture dish、及びスライドグラスが必要であることが判明した
２）p40phox以外のNADPH酵素複合体コンポーネント(主にRac)に対するsiRNAのデザインを行っている。
３）菌体細胞壁の構成成分であるグルカンが市販されているため、購入したうえで菌体成分と同様な実験結果が得られることを今後確認する。
４）菌体成分皮下投与後の肉芽種様病変の好中球Netosis観察のための条件を検討する
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| 次年度使用額が生じた理由 |
１）p40phox siRNAのデザインを複数種類発注する予定であったが、まだ発注されていないため。
２）計画していたより in vitro, in vivo での好中球 Netosis の確実な観察条件が設定に至らず、実験が進行しなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
１）p40phox 以外のNADPH 構成要素のsiRNAのデザインを複数種類発注する予定である。
２）in vitro, in vivo での好中球 Netosis の確実な観察条件設定のために、専用のスライドグラス、サイトカイン等の発注を行う。
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