| 研究課題/領域番号 |
26461490
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
竹内 康雄 北里大学, 医学部, 教授 (60286359)
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| 研究分担者 |
竹内 恵美子 北里大学, 医学部, 講師 (00406935)
大津 真 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30361330)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 好中球Netosis / 好中球活性酸素 / p40phox / siRNA |
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| 研究実績の概要 |
１．In vitro 及び In vivo における好中球Netosis の検出：好中球Netosisを正確に観察できるシステムを確立する予備実験を以下のごとく行った。マウス末梢血より磁気ビーズを用いて好中球を抽出し、直後に一般的条件の培養液に移し、PMA添加にてNetosis を誘導し以下の２点で確認した。 １）in vitro でのNetosis 検出 ①培養液上清中のDNAの検出（Cytox Green による染色） ②培養好中球の形態変化（Cytox Green＋DAPI：DNA染色及びelastase による染色）。 Netosis が起きていれば好中球の細胞外に広がっているDNAと絡みついているelastase が確認できる。添加PMA濃度及び添加後の反応時間について条件を数段階に変更して実験を繰り返し、最も確実にNetosis が観察できる条件を設定した。今後の動物モデルのNetosis 誘導実験の適切な陽性コントロール実験が確立した。
２）gp91phox遺伝子欠損(NOX2-KO) マウス好中球のNetosisの検出；NOX2-KO マウスは好中球の活性酸素が産生できないことが特徴である。活性酸素はNetosis 制御に必須とされており、本マウスではNetosis が起きやすい、起こったあとの処理がされない、などの異常が見られることが予想された。１）に基づきNOX2-KO マウス好中球にNetosis 誘導を試みた。繰り返し実験を行ったが予想に反し、Netosis は全く見られなかった。
３）BXSBマウス好中球でのNetosis 検出：ヒト全身性エリテマトーデス(SLE)の動物モデルであるBXSBマウスでのNetosis を観察した。
２．当初の計画に従いp40phox siRNAをデザインし、p40phox の遺伝子配列から最も抑制効果が期待される４箇所を設定しp40phox siRNAを作成した。また、本課題に重要であるためフローサイトメーターを使用したマウス骨髄からの造血幹細胞抽出の練習を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１）今後の研究を進めるうえで造血幹細胞を効率よく、確実にマウス骨髄から抽出することは欠かせない技術となる。現在、東京大学医科学研究所の大津博士の研究室で抽出を行っているが、抽出後に東京都内から相模原まで移送しなければならないなど研究に支障をきたす面がみられた、そこで研究効率を高めるため当医学部内で行えるように技術的な修練を行っている。
２）大学病院移転や学生教育への講義、試験システムの大幅な改定があり、診療業務、教育業務へのエフォート増加に伴い、本研究へのエフォート比率が低下したことによる。しかし、これは昨年度のみの問題であるため次年度への影響はないと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．In vitro 及び In vivo における好中球Netosis の検出: BXSBマウスの週令によりNetosis 異常の状況が異なっている可能性があるので週令により、また正常マウスとは異なるPMA添加条件でのNetosis を観察する必要がある。
２．siRNAの好中球導入によるp40phox knock-down と活性酸素産生、Netosis の観察: 得られた p40phox siRNAを正常, NOX2-KO, BXSB マウスの末梢血より抽出した好中球にリポフェクション法により遺伝子導入する。導入後にその活性酸素産生状況とNetosis の異常について解析する。
３．p40phox -siRNAの造血幹細胞導入と骨髄移植による半永久的p40phox knock-down システムの末梢血好中球への供給: 好中球は細胞寿命が短く、体外へ抽出すると短時間で細胞死に陥るため長期間観察での治療実験ができない。そこで骨髄幹細胞にsiRNAによるp40phox knock-down システムを導入し、その幹細胞を骨髄移植することでるp40phox knock-down された好中球が生体内に半永久的に供給されるので長期間に渡る状況が観察可能となる。
1) フローサイトメトリーにて、先ず正常マウス骨髄から造血幹細胞を抽出する。造血幹細胞へp40phox siRNA遺伝子導入する。この場合の導入法は、病原性を持たない研究用レトロウイルスに遺伝子を組み込み、造血幹細胞へ感染させ、細胞のDNAにへp40phox siRNAを組み込ませる。
2) 最近の研究でp40phox遺伝子欠損でも活性酸素産生障害から免疫不全症を発症することが報告された。従ってp40phox siRNAではNetosis 制御も可能かもしれないが、免疫不全を同時に発症する可能性が生じてきた。よって、NADPH complex を構成するp67phox ,
p47phox , Rac等の蛋白についても結果によってはsiRNAでによるNetosis 制御実験を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究実績の箇所での説明どおり、結果的にIn vitro 及び In vivo における好中球Netosis の検出システムは確立できたが、確実なNetosis 観察のためにPMAの添加濃度、反応時間、好中球の培養条件等の決定に相当の期間を要したため次の研究に進めなかった。 また、本研究では造血幹細胞のマウスからの効率よい抽出が重要である。現在、東京大学医科学研究所の大津博士の研究室で抽出を行っているが研究の効率を考え、フローサイトメトリーによるマウス造血幹細胞抽出を大津博士の研究室で、すでに保有している試薬を使用して行ったため使用金額が少なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度予定のマウス飼育代、消耗品代に加えて、BXSBマウスやsiRNA作成等、昨年度に予定されていた使用額が本年度になること、マウス造血幹細胞抽出に必要なフローサイトメトリーの運転、使用する試薬等に係る費用が加わるため相当の使用金額になることが見込まれる。
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