| 研究課題/領域番号 |
26461511
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
平松 和史 大分大学, 医学部, 准教授 (80301381)
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| 研究分担者 |
門田 淳一 大分大学, 医学部, 教授 (50233838)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 緑膿菌 / siRNA / バイオフィルム / グリコカリックス / アルギン酸 |
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| 研究実績の概要 |
緑膿菌バイオフィルム形成の最終段階であるグリコカリックスやアルギン酸産生に対するRNA干渉によるin vitroでの抑制効果やマウス腹腔内バイオフィルム感染モデルにおけるsiRNAの効果について本研究のなかで検討を進めている。昨年度設計を行ったグリコカリックス関連遺伝子PelA、PslAおよびアルギン酸関連遺伝子であるAlgU遺伝子に対するsiRNAにコレステロールを修飾したものの合成を行った。蛍光色素をsiRNAに付加し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡でムコイド非産生株の緑膿菌を観察すると、siRNAに蛍光色素を付加したものでは緑膿菌の発色をほとんど認めなかった。一方、siRNAにコレステロール修飾を行い、蛍光付加したものでは多くの緑膿菌で蛍光発色していた。こうした結果はコレステロール修飾したsiRNAが緑膿菌には非修飾のsiRNAより効率的に取り込まれていることを示唆している。現在、さらに高効率にsiRNAが取り込まれるようにするために、コレステロール以外の修飾物質としてメチオニンやグルコースを付加したsiRNAの作成を外部業者に委託している。またムコイド産生の緑膿菌株に対するコレステロール修飾あるいは非修飾のsiRNAの取り込み状況についても検討を行っている。PelAやPslAのsiRNAによるグリコカリックス産生に対する効果については、シリコン片に付着させた緑膿菌にPelAおよびPslAのsiRNAを作用させ、シリコン片上のグリコカリックス量をクリスタルバイオレット法で定量した。PelAやPslAに対するコレステロール修飾siRNAではグリコカリックス産生量の十分な抑制効果は認めなかった。現在siRNAの濃度を変更して、グリコカリックス産生に対する効果を検証している。さらにAlgUに対するsiRNAによるアルギン酸の産生量についても検証を行うための準備を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成27年度の計画ではマウス腹腔内バイオフィルム感染モデルにおけるsiRNAの効果の検討を行う予定であった。しかしながら、in vitroにおけるsiRNAの効果の検証が十分に行えていないため、in vivoの感染実験は実施できていない。またin vitroにおけるsiRNAと抗菌薬との併用効果に関する検討も実施できていないため、やや遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度もin vitroにおけるPelA、PslA、AlgUのsiRNAの効果について、クリスタルバイオレット法やHPLC法を用いてグリコカリックスやアルギン酸産生量について検討を行う。また同時にin vivoでのsiRNAの効果を検討するためのマウス腹腔内バイオフィルム感染モデルの作成を行う。さらにin vitroでのsiRNAのバイオフィルム産生抑制効果が認められれば、マウスモデルにおけるsiRNAの効果についても検討を進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
siRNAの合成や合成siRNAへのメチオニン、グルコース、コレステロール修飾などは外部業者に委託して行っている。こうした修飾に時間を要し、in vitroでのsiRNAのバイオフィルム産生抑制効果の検討の実施が遅れた。さらに、クリスタルバイオレット法によるグリコカリックス産生抑制効果が認められなかったため、in vivoの実験が行えなかった。そのためにマウス購入費やin vivo実験で用いる予定であった試薬などの購入を行わず次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に実施できなかったin vivoにおける実験を平成28年度に実施予定である。そのためにマウスの購入を予定している。またin vivo実験に用いる試薬などの購入を行う。さらにin vivo実験では大量のsiRNAが必要であるため、in vitroの実験で効果の認められたsiRNAの購入を行う予定である。
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