| 研究課題/領域番号 |
26461512
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40336673)
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| 研究分担者 |
長谷川 忠男 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10314014)
前山 順一 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50311642)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 二成分制御因子 / 転写因子 / A群連鎖球菌 / 人食いバクテリア / バイオフィルム / 環境因子 |
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| 研究実績の概要 |
劇症型溶血性A 群連鎖球菌による感染症は、発病後数十時間以内に急激な筋膜壊死をもたらせる。A 群連鎖球菌は、猩紅熱を発症することで知られているが、劇症型へ変異すると人食いバクテリアと称される感染症を引き起こし、変異する機構は未だ解明されていない。劇症型発症に関する研究を実施するにあたり、私たちがまず着目したのは、A 群連鎖球菌と同属のストレプトコッカス・ミュータンス菌が酪酸とバイオフィルムを産生し、虫歯の増悪因子となっているということである。A 群連鎖球菌も糖代謝で酸を産生することはわかっているが、この酸がもたらすさまざまな機序はまだ解明されていない。そこで私たちは、この酸が劇症化に関わっていると考え、細菌が外界からの酸を感受する部位である二成分制御因子の変異や欠損が原因の一助と推測し、A 群連鎖球菌の劇症型感染症の責任遺伝子の同定とその発症機構の解析を目的とした。
今年度はA 群連鎖球菌の劇症化制御遺伝子群の解析の為、酸刺激後の劇症型および非劇症株よりRNAの抽出、抽出RNAの精製度、リアルタイムPCRに至までのプライマー設定の各条件を検討した。その結果、従来のリゾチーム溶解だけではなく、細胞壁溶菌酵素ムタノリジンの追加変更で従来のRNA回収率を大幅に増加させる事が明らかになった。また抽出RNAの精製度は、リアルタイムPCRの使用に適するRNAが得られた。リアルタイムPCRの結果は、転写制御因子Mgaの影響が認められた。今後の解析により、糖代謝に関与するCcpA、Rgg,RopBなどの調節因子と、酸刺激による劇症型発症機構が明らかになれば、A 群連鎖球菌の劇症型発症の抑制と抗生物質を使わない治療が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
A群連鎖球菌からの精製度の高いRNA抽出は、大腸菌等の抽出に比して条件として得にくいが、抽出条件の改良により大幅なRNA回収効率を見いだせた事から実験初期段階での条件設定はクリアしたと考えた。
リアルタイムPCRによる転写因子の解析条件は、プライマー設計に依存し結果がばらつくと言われている。副反応がない条件でのプライマーが設計された事は、以後の結果に反映される事、およびその結果が得られた事から、おおむね当初の計画通り進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに条件設定がされたMga,CcpA,Rggを含め、１３種類の二成分制御因子のノックアウト株で酸刺激で反応を示した株からRNA抽出を行ない、各転写因子の相互作用を解析する。
またノンコーディングリージョンRNAやリン酸化タンパク質の活性も視野に入れて劇症型発症機構を明らかにする。リン酸化タンパク質の同定または網羅的解析により、どの二成分制御系因子が実際にリン酸化を行ない、他のリン酸化タンパク質のリレー系を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
この費用について、前年度から作製している英語論文の校正、投稿が年度末にずれ込んた為、その年度までに使用されなかった費用である。
平成２５年４月末現在、英語論文を作製、校正、投稿の準備は整っており、この費用にあてて使用する予定です。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成２５年１月より、今回使用している二成分制御系因子とバイオフィルム産生について結果をまとめて、英語論文を作製している。この英語論文を投稿すべく、学術誌への投稿費用、その準備等の費用として計上致します。 理由は上記述べたごとく、前年度に相当する平成２５年年始からの論文作製で使用が出来なかった為です。
また、リアルタイムPCRによる解析に使用する消耗品を中心とした研究費を申請致します。
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