| 研究課題/領域番号 |
26461512
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40336673)
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| 研究分担者 |
長谷川 忠男 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10314014)
前山 順一 国立感染症研究所, その他部局等, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50311642)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 二成分制御因子 / 転写因子 / A群連鎖球菌 / 人食いバクテリア / バイオフィルム / 環境因子 |
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| 研究実績の概要 |
劇症型溶血性A 群連鎖球菌による感染症は、発病後数十時間以内に急激な筋膜壊死をもたらせる。A 群連鎖球菌は、猩紅熱を発症することで知られているが、劇症型へ変異すると人食いバクテリアと称される感染症を引き起こし、変異する機構は未だ解明されていない。劇症型発症に関する研究を実施するにあたり、私たちがまず着目したのは、A 群連鎖球菌と同属のストレプトコッカス・ミュータンス菌が酪酸とバイオフィルムを産生し、虫歯の増悪因子となっているということである。A 群連鎖球菌も糖代謝で酸を産生することはわかっているが、この酸がもたらすさまざまな機序はまだ解明されていない。そこで私たちは、この酸が劇症化に関わっていると考え、細菌が外界からの酸を感受する部位である二成分制御因子の変異や欠損が原因の一助と推測し、A 群連鎖球菌の劇症型感染症の責任遺伝子の同定とその発症機構の解析を目的とした。今年度はA 群連鎖球菌の劇症化制御遺伝子群の解析の為、酸によるバイオフィルム産生を指標として、リアルタイムPCRによる酸刺激後の劇症型および非劇症株の遺伝子群の変化の解析と、それに伴うプロモーター活性の検討した。
その結果、リアルタイムPCRの結果は、外膜タンパク質Mタンパク遺伝子emmの転写を制御する転写制御因子Mgaの影響が、劇症型に影響をおよぼすと考えられる二成分制御因子spy1588ノックアウト株において認められた。そして、この制御遺伝子のプロモーターが、培養中の酸に影響されていることも解析された。環境中の酸でバイオフィルム産生と劇症型への方向性につながる一つの結果が得られた。今後の解析により、上記結果の一連の反応系に由来する他のRgg,RopBなどの調節因子と、酸刺激による劇症型発症機構が明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７年度実施計画
（１）二成分制御因子変異株と劇症型分離株とのRgg-RopB,RafA遺伝子の発現量の差異
（２）バイオフィルムタンパク質抽出と新規タンパク質同定およびその遺伝子の特定
成果として、（１）のRgg-RopBのspy1588変異株および劇症型株との遺伝子発現の変化をリアルタイムPCRで実施すると、RopB発現が変異株で低下していた。このことからRopBの制御がバイオフィルムにも起因すると考えられた。
（２）では、1588変異株で産生されなかったタンパク質についてバイフィルム構成タンパク質とみなを質量分析装置で解析した。すると変異株ではMタンパク質が欠損していることが明らかとなった。このタンパク質の遺伝子emmの発現調節を担うタンパク質Mgaのプロモーター解析を、変異株、劇症株と共に、酸および中性状況下で行った。すると、酸性状況下でこのプロモーターが活性化していることが明らかとなった。RopBの低下と含めてさらに関連性を調べている。また、1622変異株欠損株由来のバイオフィルムタンパク質を質量分析した結果、繊毛タンパク質であることが明らかとなった。二成分制御系spy1622が酸を感受して繊毛タンパク質を産生し、バイオフィルム産生をする経路を見いだす事が出来た。この結果は論文投稿済みです。
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| 今後の研究の推進方策 |
A群連鎖球菌は１３種類の二成分制御因子が存在すると報告されている。その因子とバイオフィルムとの関連性を調べるために、転写因子を検索することは必須である。少なくとも二つの二成分制御因子とバイオフィルムとの関連性は調査した。これらの結果から考え、遺伝子発現の増減で検索も可能だが莫大な量のデータから得られる結果が少ない。そこで本年度は、変異株から推測されたバイオフィルム産物からそのタンパク質のプロモーターを検索し、そこに結合する発現転写調節因子を回収して質量分析により新規転写因子の一連の反応を明らかにする。
具体的には、二成分制御因子spy1588変異株で確認されたバイオフィルムタンパク質２種類のプロモーターについて、A連鎖球菌データベースから遺伝子配列を選別する。推測されるプロモーター配列のDNAを合成しビオチン化標識し、A群連鎖球菌ライセートに転化して転写因子と結合させる。結合化したタンパク質は磁気ビーズで回収、電気泳動で精製後、質量分析を行う。
また各タンパク質がRopBおよび酸により変動するかをさらに調べるためにプロモーター解析をルシフェラーゼ法によって確かめる。一連の調査からの結果で反応に相関が認められれば、MgaとRopBの二つの転写因子が関与してタンパク質発現制御を行っていることが明らかとなる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
英語論文投稿の編集のために計上していたが、論文作成に時間がかかり提出が遅れたため、年度を越えてしまい、残金が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
論文作製及びオープンアクセスに対する費用計上を予定している。
また、質量分析法による転写因子解析を実施するために、費用がかかりますため、その解析に使用いたします。
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