次世代シーケンサーを用いたヌーナン症候群類縁疾患の網羅的遺伝子診断システムの確立

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26461520
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 新堀 哲也 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40436134)
• 研究分担者: 松原 洋一 独立行政法人国立成育医療研究センター, その他部局等, その他 (00209602) ; 青木 洋子 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80332500)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 次世代シークエンサー / ヌーナン症候群 / コステロ症候群 / CFC症候群

研究実績の概要

ヌーナン症候群およびその類縁疾患の次世代シークエンサーを用いた網羅的な遺伝子解析手法を確立することを目的とし、PCRアンプリコン解析の条件検討をを行った。
我々はこれまで、ヌーナン症候群およびその類縁疾患の遺伝子解析をキャピラリーシークエンサーで行ってきたが、その解析に使われたPCRプライマーをそのまま使用するための条件を検討した。最近新しい原因遺伝子として、RRAS、A2ML1、RASA2、SOS2、LZTR1が報告されているが、今回の解析対象遺伝子はPTPN11、HRAS、KRAS、BRAF、MEK1、MEK2、SOS1、RAF1、SHOC2、NRAS、CBL、RIT1の12遺伝子、150アンプリコンとした。1組ずつでのPCRの増幅条件は既にわかっているが、アニーリング温度は54℃‐62℃と幅が広かった。また、手技の簡略化および必要なDNA量を減らすため、1ウェル中で複数領域の増幅を行うマルチプレックスPCRでのアニーリング温度の条件検討を行った。まず25程度ずつ6分割したマルチプレックスPCRにおいてアニーリング温度を振って増幅の確認を行った。その結果、良好な増幅が得られたため、1ウェルでの増幅を行い、詳細な増幅の偏りの評価は読み取ったリードにより行うこととした。これまでの研究により、遺伝子変異陽性検体の集積があるため、それらを陽性対照としてデスクトップ型次世代シークエンサーにより塩基読み取りを行った。現在データ解析中である。これらの研究は東北大学大学院医学系研究科倫理委員会での承認を受けている。
本手法が確立されれば、これまで一人ひとり、一つ一つの遺伝子について順次行われていた解析が複数人について全ての対象遺伝子の解析が1回の実験で可能となり、効率化が達成できる。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成26年度中の解析系の確立を目指したが、次世代シークエンサーの不具合およびそのトラブルシューティングにより、塩基読み取りの開始が遅れた。multiplex PCRでの増幅は出来ていると考えられるが、次世代シークエンサーで読み取った結果の詳細な解析が必要である。

今後の研究の推進方策

読み取り領域を詳細に解析し、必要があればプライマー濃度の調整、プライマーの変更・追加などを行っていく予定である。今後は陽性対照の解析をさらに行い、新規検体の解析も行っていく。当面はキャピラリーシークエンサーでの解析を併用する。

研究成果

• [雑誌論文] Mutations in PIGL in a patient with Mabry syndrome. (2015)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara I, Murakami Y, Niihori T, Kanno J, Hakoda A, Sakamoto O, Okamoto N, Funayama R, Nagashima T, Nakayama K, Kinoshita T, Kure S, Matsubara Y, Aoki Y.
  • 雑誌名: Am J Med Genet A. 巻: 167 ページ: 777-785
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.36987
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted Next-Generation Sequencing Effectively Analyzed the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene in Pancreatitis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakano E, Masamune A, Niihori T, Kume K, Hamada S, Aoki Y, Matsubara Y, Shimosegawa T.
  • 雑誌名: Dig Dis Sci. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s10620-014-3476-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] A novel heterozygous MAP2K1 mutation in a patient with Noonan syndrome with multiple lentigines. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nishi E, Mizuno S, Nanjo Y, Niihori T, Fukushima Y, Matsubara Y, Aoki Y, Kosho T.
  • 雑誌名: Am J Med Genet A. 巻: 167 ページ: 407-411
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.36842.
  • 査読あり
• [雑誌論文] GNE myopathy associated with congenital thrombocytopenia: a report of two siblings. (2014)
  • 著者名/発表者名: Izumi R, Niihori T, Suzuki N, Sasahara Y, Rikiishi T, Nishiyama A, Nishiyama S, Endo K, Kato M, Warita H, Konno H, Takahashi T, Tateyama M, Nagashima T, Funayama R, Nakayama K, Kure S, Matsubara Y, Aoki Y, Aoki M.
  • 雑誌名: Neuromuscul Disord. 巻: 24 ページ: 1068-1072
  • DOI: 10.1016/j.nmd.2014.07.008.
  • 査読あり
• [雑誌論文] New BRAF knockin mice provide a pathogenetic mechanism of developmental defects and a therapeutic approach in cardio-facio-cutaneous syndrome. (2014)
  • 著者名/発表者名: Inoue S, Moriya M, Watanabe Y, Miyagawa-Tomita S, Niihori T, Oba D, Ono M, Kure S, Ogura T, Matsubara Y, Aoki Y.
  • 雑誌名: Hum Mol Genet. 巻: 23 ページ: 6553-6566
  • DOI: 10.1093/hmg/ddu376.
  • 査読あり
• [学会発表] 次世代シークエンサーを用いた希少遺伝性難病病因遺伝子の探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 新堀哲也、井泉瑠美子、西山亜由美、矢尾板全子、大場大樹、守谷充司、井上晋一、舟山亮、城田松之、中山啓子、松原洋一、青木洋子
  • 学会等名: 第３回生命医薬情報学連合大会
  • 発表場所: 仙台国際センター（仙台市）
  • 年月日: 2014-10-02 – 2014-10-04