| 研究課題/領域番号 |
26461593
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
志田 泰明 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (10721566)
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| 研究分担者 |
野上 恵嗣 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (50326328)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 血流 / 血管内皮細胞 / 血友病 / フォン･ヴィレブランド病 / 血栓 |
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| 研究実績の概要 |
血流により生じるずり応力は血管内皮において遺伝子の発現に影響を与えることで、血管の恒常性を維持に関与している。層流はAnti-thrombotic な、乱流はpro-thrombotic な影響があると考えられている。血液凝固因子第VIII 因子（FVIII）が産生される部位は未だ議論されているが、血管内皮細胞が第一の候補となっている。（Shida Y. et al, 血栓止血誌 2015；26（1）：49-56）また、von Willebrand factor(VWF)も血管内皮細胞において生成されるが、血流と発現の関連は不明な点が多い。我々は血流がFVIII やVWF の血管内皮細胞での発現に影響を及ぼす検討し、血管内皮における新たな血栓形成メカニズムを明らかにする。1)血流が血管内皮におけるFVIII やVWF のmRNA 発現や蛋白生成に及ぼす影響の解析2）VWF、FVIII の局在、相互作用の検討 3）血管内皮上での血栓形成モデルの開発 を目指している。このうち本年度は1)において重要となる循環ポンプシステムを用いた血管内皮細胞培養システムの構築を試みた。血管内皮細胞としてはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）を用いた。Flow chamber内にHUVECｓを培養し、接着したところでibidi社の循環ポンプシステムにセットし、3日間の培養を高ずり速度下、低ずり速度下、乱流下、の3条件で培養して細胞形態を観察した。高ずり速度下で細胞は血流に沿うように細胞の形態を変化させたが、低ずり速度下、乱流下では形態の変化は認めなかった。現在免疫染色にてFVIIIやVWFがどのようにHUVECｓの中に局在するかを検討中である。2)としてはBlood outgrowth endothelial cells (BOECs)の採取を検討している。血友病やフォン･ヴィレブランド病患者からのBOECｓを解析することで検討できる。3)としてはコラーゲン上にできる血栓を解析するフローチャンバーシステムを構築した。将来的には血管内皮上でのシステムに改良していきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ibidi社の循環培養できるポンプシステムを導入したが、セットアップの段階で、適正に使用していたにもかかわらず、機械が作動しない、エラーメッセージが出て機械が止まる、などのトラブルが発生したために、機械を点検に出さねばならず、実験ができない時期があった。（原因としてはケーブルの断線が存在したこと、他の装置の電気ノイズの影響がでていて電源の取り方を工夫する必要があったことがあげられる。）以前すべてのトラブルは解消されてはいないが、3日間の培養に耐えるシステムとすることに成功したため、これから種々の条件におけるデータを集積していく予定である。もう一点の遅れの原因として血管内皮細胞のソースとしてHUVECｓの他にBlood outgrowth endothelial cells (BOECs)の使用を検討しているが、BOECｓの採取が進まなかった。血液から培養できる血管内皮の前駆幹細胞であるが、数人のドナーから採取を試みたものの現時点では最終できていない。細胞の遠心条件や培養条件を種々試していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
血管内皮細胞は血流に応答して形態を変化させる能力を有する。高ずり速度下で発揮されることがわかったが、次の段階として分子レベルあるいはmRNAでの解析を進めていく予定である。特に我々は当教室の特徴である凝固因子およびその阻止因子に注目しており、新規の血栓治療戦略を構築したいと考えている。細胞の形態変化とFVIIIやVWFの発現量やパターンの関連を解析していく予定である。BOECｓの採取にも力を入れていき、健常人で採取が成功すれば血友病やフォン･ヴィレブランド病患者からの細胞を培養していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ibidiポンプの不調により実験が進められなかった時期があり、予想よりも消耗品の消費が少なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
機械の不具合の改善されたため、計画通りに実験を進めていく予定である。
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