2015 年度実施状況報告書

癌抑制遺伝子INPP4Bの欠失を基盤とするメラノーマ発生・進展の分子機構

研究課題

研究課題/領域番号	26461679
研究機関	秋田大学
研究代表者	眞鍋求秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30138309)
研究期間 (年度)	2014-04-01 – 2017-03-31
キーワード	INPP4B / PI3K / メラノーマ / 癌抑制遺伝子 / 遺伝子改変マウス
研究実績の概要	INPP4BはPI(3,4)P2のイノシトール環水酸基を脱リン酸化しPI(3)P2へ変換する作用を持つイノシトールリン脂質代謝酵素である。PI(3,4)P2がPI(3,4,5)P3と類似の機能を持つことより、INPP4Bは癌抑制遺伝子産物として機能しているものと推定され、最近注目を集めている。そこで、本研究課題では、メラノーマ発生・進展におけるINPP4Bの生物学的役割を解明するため、メラノサイト特異的にInpp4bを欠失した遺伝子改変マウスを用いて、細胞増殖能、アポトーシス抵抗性、各種シグナル伝達分子の相互作用などを解析するとともに、腫瘍の発生頻度や選択的阻害による転移能の抑制効果を検討する。この課題を達成するため、まずDct-CreマウスとInpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスを交配して、色素細胞特異的Inpp4bホモ欠損マウス、Ptenホモ欠損マウス、Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成した。しかし、これらのマウスでは、色素細胞由来の良性腫瘍である色素細胞母斑は発生したものの、メラノーマへ進展することは無いことが判明した。そのため、これらのマウスを用いた本研究戦略を断念し、あらたにTamoxifen誘導型Tyr-Cre：Braf変異＋Pten欠損マウスを用いて、今後の研究を遂行することにした。すなわち、此のマウスをInpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスと交配して、Tamoxifen誘導型Braf変異＋Inpp4bホモ欠損マウス、Braf変異＋Ptenホモ欠損マウス、Braf変異＋Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成している。その結果、Tamoxifen誘導型Braf変異＋Ptenホモ欠損では、メラノーマの自然発生が確認された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 Tamoxifen誘導型Tyr-Cre：Braf変異＋Pten欠損マウスを用いて、Inpp4b-flox/floxマウスないしPten-flox/floxマウスと交配して、Tamoxifen誘導型Braf変異＋Inpp4bホモ欠損マウス、Braf変異＋Ptenホモ欠損マウス、Braf変異＋Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成中であるが、マウスの繁殖と交配に時間がかかり、十分な個体数が確保できていない。しかし、中間段階にあるマウスが続々と繁殖しているので、近日中に必要な個体数が確保でき、研究計画の良好な進展が得られるものと楽観している。また、此らのマウスに生じたメラノーマに関して、糖代謝の観点から新規治療法を開発することを同時に開始した。すなわち、がん細胞においては糖代謝が亢進していることが知られているので、その選択的阻害を介して、細胞にオートファジーを誘導し、次いでオートファジーを阻害することにより細胞死を惹起することを試みている。現時点では萌芽段階ではあるが、この戦略によりメラノーマに選択的細胞死を誘導できることが判明した。オートファジーの関連経路の阻害を介して、画期的な癌治療法を開発すべく、新たな準備実験を進行させている。
今後の研究の推進方策	メラノーマ発生・進展におけるINPP4B の生物学的役割を解明するため、Tamoxifen誘導型の色素細胞特異的Braf変異＋Inpp4bホモ欠損マウス、Braf変異＋Ptenホモ欠損マウス、Braf変異＋Inpp4bホモ・Ptenホモ欠損マウスを作成し、以下の研究を実施する。まず、メラノサイト幹細胞の生存維持におけるPTENとINPP4Bの相互作用を解析するため、上記の遺伝子改変マウスよりメラノサイトを採取して培養し、細胞増殖能を比較するとともに、放射線を照射した後、生存している細胞数を比較する。また、Ptenホモ欠失のため想定されるPI3K/AKT経路のシグナル伝達分子の発現と活性化が、INPP4bのホモ欠失により促進されるかを検討するため、PI3K/AKT経路の下流にあるシグナル伝達分子の動態を免疫ブロットにより解析する。次いで、Ptenのホモ欠失によるメラノーマ発生が、Inpp4bのホモ欠失により促進されるかを検討するため、上記の遺伝子改変マウスにおける、メラノーマの発生率を経時的に長期解析する。さらに、Ptenホモ欠失メラノーマ細胞の細胞特性は、INPP4Bの欠失することにより変化する可能性がある。そこで、化学発癌処理を加えた上記の遺伝子改変マウスよりメラノーマ細胞を採取・培養し、コロニー形成能、スフェロイド形成能、低血清培地増殖能などを軟寒天培地法、非接着培養プレート法やＭＴＴアッセイにより比較する。また、メラノーマ細胞におけるPTENとINPP4Bの相互作用を解析するため、PI3K/AKT経路の下流にあるシグナル伝達分子の動態を免疫ブロットにより解析するとともに、放射線照射後のアポトーシス関連分子の動態を同様に解析する。併せて、メラノーマ細胞において、糖代謝を介したオートファジーの選択的誘導とその阻害を利用した新規治療法の開発を試みる。